17-10143
Biocapteur lentiviral LentiBrite RFP-LC3
Synonyme(s) :
Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3, Autophagy-related protein LC3, Autophagy-related ubiquitin-like modifier LC3, MAP1A/MAP1B light chain 3, Microtubule-associated protein 1 light chain 3
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About This Item
Code UNSPSC :
12352207
eCl@ss :
34360190
Nomenclature NACRES :
NA.32
Produits recommandés
Description générale
Également disponible : Biocapteur lentiviral LentiBrite GFP-p62 ! Cliquez ici
Également disponible : Biocapteur lentiviral LentiBrite RFP-p62 ! Cliquez ici
Lisez notre note d'application dans Nature Methods !
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
(Cliquez ici !)
En savoir plus sur les avantages de nos Biocapteurs lentiviraux LentiBrite ! Cliquez ici
Les biocapteurs peuvent être utilisés pour détecter la présence / l'absence d'une protéine particulière ainsi que la localisation intracellulaire de cette protéine dans une cellule à l'état vivant. Les marqueurs fluorescents sont souvent prisés comme moyen de visualiser la protéine d'intérêt dans une cellule par microscopie à fluorescence ou par capture vidéo par intervalles (time-lapse). La visualisation des cellules vivantes sans perturbation permet aux chercheurs d'observer les conditions cellulaires en temps réel.
Les systèmes à vecteur lentiviral sont un outil de recherche populaire utilisé pour introduire des produits géniques dans les cellules. La transfection lentivirale présente des avantages par rapport aux méthodes non virales comme la transfection chimique, notamment une transfection à plus haute efficacité des cellules en division et non en division, une expression stable à long terme du transgène et une immunogénicité faible.
EMD Millipore présente les biocapteurs lentiviraux LentiBrite, une nouvelle gamme de particules lentivirales pré-emballées codant pour des protéines importantes et fondamentales de l'autophagie, de l'apoptose et de la structure cellulaire, pour une visualisation sous différents états cellulaires/pathologiques dans des cellules vivantes et en analyses in vitro.
Les particules lentivirales LentiBrite RFP-LC3 de EMD Millipore apportent une fluorescence intense et une localisation précise pour permettre l'analyse de l'autophagie sur des cellules vivantes dans des types cellulaires difficiles à transfecter.
Également disponible : Biocapteur lentiviral LentiBrite RFP-p62 ! Cliquez ici
Lisez notre note d'application dans Nature Methods !
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
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Les biocapteurs peuvent être utilisés pour détecter la présence / l'absence d'une protéine particulière ainsi que la localisation intracellulaire de cette protéine dans une cellule à l'état vivant. Les marqueurs fluorescents sont souvent prisés comme moyen de visualiser la protéine d'intérêt dans une cellule par microscopie à fluorescence ou par capture vidéo par intervalles (time-lapse). La visualisation des cellules vivantes sans perturbation permet aux chercheurs d'observer les conditions cellulaires en temps réel.
Les systèmes à vecteur lentiviral sont un outil de recherche populaire utilisé pour introduire des produits géniques dans les cellules. La transfection lentivirale présente des avantages par rapport aux méthodes non virales comme la transfection chimique, notamment une transfection à plus haute efficacité des cellules en division et non en division, une expression stable à long terme du transgène et une immunogénicité faible.
EMD Millipore présente les biocapteurs lentiviraux LentiBrite, une nouvelle gamme de particules lentivirales pré-emballées codant pour des protéines importantes et fondamentales de l'autophagie, de l'apoptose et de la structure cellulaire, pour une visualisation sous différents états cellulaires/pathologiques dans des cellules vivantes et en analyses in vitro.
- Pré-emballés, marqués par fluorescence avec la GFP et la RFP
- Transfection à plus haute efficacité par rapport aux méthodes traditionnelles de transfection chimique et autres méthodes non virales
- Possibilité de transfecter des cellules en division, non-en division, et des types cellulaires difficiles à transfecter, tels que les cellules primaires ou les cellules souches
- Ne perturbe pas les fonctions cellulaires
Les particules lentivirales LentiBrite RFP-LC3 de EMD Millipore apportent une fluorescence intense et une localisation précise pour permettre l'analyse de l'autophagie sur des cellules vivantes dans des types cellulaires difficiles à transfecter.
L'autophagie, une voie de dégradation qui fournit aux cellules des nutriments recyclés en cas de stress, joue un rôle à la fois protecteur et délétère dans de nombreuses maladies, y compris le cancer, la neurodégénérescence et les infections. Les membres de la famille LC3 jouent un rôle clé dans la maturation de l'autophagosome, l'organite central de l'autophagie. Les précurseurs de LC3, distribués de façon diffuse dans le cytosol, sont traités protéolyse pour former le LC3-I. Lors de l'initiation de l'autophagie, la glycine C-terminale est transformée en LC3-II par addition d'une phosphatidyléthanolamine par Atg5-Atg12. Le LC3-II subit rapidement une translocation vers des autophagosomes naissants selon une distribution ponctuée. Des ADN de synthèse codant pour des protéines fluorescentes fusionnées à LC3 sont largement utilisés pour introduire celles-ci dans les cellules afin de suivre la formation des autophagosomes par microscopie de fluorescence.
Les particules lentivirales LentiBrite RFP-LC3 d'EMD Millipore apportent une fluorescence intense et une localisation précise pour permettre l'analyse de l'autophagie sur cellules vivantes dans les types cellulaires difficiles à transfecter.
Les particules lentivirales LentiBrite RFP-LC3 d'EMD Millipore apportent une fluorescence intense et une localisation précise pour permettre l'analyse de l'autophagie sur cellules vivantes dans les types cellulaires difficiles à transfecter.
Application
Imagerie par microscopie à fluorescence :
(Voir la figure 1 de la fiche technique)
Des cellules souches mésenchymateuses humaines (HuMSC) de type primaire ont été déposées sur une lame à chambre de culture et ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 20 pendant 24 heures. Après remplacement du milieu et 48 heures d'incubation supplémentaires, les cellules ont été soit laissées dans un milieu complet soit incubées pendant 4 heures dans du tampon EBSS contenant un inhibiteur du lysosome, pour induire l'autophagie et inhiber la dégradation lysosomale des autophagosomes.
Les cellules ont été fixées avec du formaldéhyde et montées sur lame. Les images ont été obtenues par microscopie à fluorescence à champ large avec immersion dans l'huile. Le RFP-LC3 présente une distribution cytosolique diffuse dans les cellules nourries et une distribution ponctuée dans les cellules autophagiques non nourries.
Comparaison par immunocytochimie et analyse d'inhibiteur :
(Voir la figure 2 de la fiche technique)
Comme pour la figure 1, des cellules HeLa ont été déposées sur une lame à chambre de culture et ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 40 pendant 24 heures. Après remplacement du milieu et 48 heures d'incubation supplémentaires, les cellules ont été soit laissées dans un milieu complet, soit incubées pendant 4 heures dans du tampon EBSS contenant un inhibiteur du lysosome pour induire l'autophagie et inhiber la dégradation lysosomale, soit incubées comme précédemment et avec ajout de 3-méthyladénine (3-MA) à 5 mM comme inhibiteur de l'autophagie. La 3-MA bloque complètement la formation des points autophagiques positifs au RFP-LC3. La coloration immunocytochimique (vert) des mêmes champs de vision avec un anticorps monoclonal dirigé contre LC3A révèle des profils d'expression similaires à la protéine RFP (rouge).
Type cellulaire difficile à transfecter :
(Voir la figure 3 de la fiche technique)
Des cellules HUVEC de type primaire ont été déposées sur une lame à chambre de culture et ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 20 pendant 24 heures. Les traitements ultérieurs pour les cellules laissées en milieu complet ou les cellules incubées en tampon EBSS avec un inhibiteur du lysosome, ont été effectués comme dans les figures 1A et 1B.
Imagerie par microscopie confocale :
(Voir la figure 4 de la fiche technique)
Des cellules HeLa ont été traitées comme dans les figures 1A et 1B. Les images ont été obtenues par microscopie confocale à fluorescence avec immersion dans l'huile.
Autre type cellulaire :
(Voir la figure 5 de la fiche technique)
Des cellules HT1080 ont été traitées comme dans les figures 1A et 1B.
Pour une visualisation optimale de la fluorescence et une analyse optimale sur cellules vivantes, il est recommandé d'analyser le niveau d'expression de la cible dans les 24 à 48 heures qui suivent la transfection / l'infection, car l'intensité de la fluorescence peut diminuer au fil du temps, en particulier dans les lignées cellulaires difficiles à transfecter. Les cellules infectées peuvent être congelées après une transfection/infection réussie et décongelées en culture pour conserver une expression fluorescente positive au-delà de 24 à 48 heures. La longueur et l'intensité de l'expression fluorescente varient entre les lignées cellulaires. Des valeurs de MOI plus élevées peuvent être nécessaires pour les lignées cellulaires difficiles à transfecter.
(Voir la figure 1 de la fiche technique)
Des cellules souches mésenchymateuses humaines (HuMSC) de type primaire ont été déposées sur une lame à chambre de culture et ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 20 pendant 24 heures. Après remplacement du milieu et 48 heures d'incubation supplémentaires, les cellules ont été soit laissées dans un milieu complet soit incubées pendant 4 heures dans du tampon EBSS contenant un inhibiteur du lysosome, pour induire l'autophagie et inhiber la dégradation lysosomale des autophagosomes.
Les cellules ont été fixées avec du formaldéhyde et montées sur lame. Les images ont été obtenues par microscopie à fluorescence à champ large avec immersion dans l'huile. Le RFP-LC3 présente une distribution cytosolique diffuse dans les cellules nourries et une distribution ponctuée dans les cellules autophagiques non nourries.
Comparaison par immunocytochimie et analyse d'inhibiteur :
(Voir la figure 2 de la fiche technique)
Comme pour la figure 1, des cellules HeLa ont été déposées sur une lame à chambre de culture et ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 40 pendant 24 heures. Après remplacement du milieu et 48 heures d'incubation supplémentaires, les cellules ont été soit laissées dans un milieu complet, soit incubées pendant 4 heures dans du tampon EBSS contenant un inhibiteur du lysosome pour induire l'autophagie et inhiber la dégradation lysosomale, soit incubées comme précédemment et avec ajout de 3-méthyladénine (3-MA) à 5 mM comme inhibiteur de l'autophagie. La 3-MA bloque complètement la formation des points autophagiques positifs au RFP-LC3. La coloration immunocytochimique (vert) des mêmes champs de vision avec un anticorps monoclonal dirigé contre LC3A révèle des profils d'expression similaires à la protéine RFP (rouge).
Type cellulaire difficile à transfecter :
(Voir la figure 3 de la fiche technique)
Des cellules HUVEC de type primaire ont été déposées sur une lame à chambre de culture et ont été soumises à une transduction avec des particules lentivirales à une valeur de MOI de 20 pendant 24 heures. Les traitements ultérieurs pour les cellules laissées en milieu complet ou les cellules incubées en tampon EBSS avec un inhibiteur du lysosome, ont été effectués comme dans les figures 1A et 1B.
Imagerie par microscopie confocale :
(Voir la figure 4 de la fiche technique)
Des cellules HeLa ont été traitées comme dans les figures 1A et 1B. Les images ont été obtenues par microscopie confocale à fluorescence avec immersion dans l'huile.
Autre type cellulaire :
(Voir la figure 5 de la fiche technique)
Des cellules HT1080 ont été traitées comme dans les figures 1A et 1B.
Pour une visualisation optimale de la fluorescence et une analyse optimale sur cellules vivantes, il est recommandé d'analyser le niveau d'expression de la cible dans les 24 à 48 heures qui suivent la transfection / l'infection, car l'intensité de la fluorescence peut diminuer au fil du temps, en particulier dans les lignées cellulaires difficiles à transfecter. Les cellules infectées peuvent être congelées après une transfection/infection réussie et décongelées en culture pour conserver une expression fluorescente positive au-delà de 24 à 48 heures. La longueur et l'intensité de l'expression fluorescente varient entre les lignées cellulaires. Des valeurs de MOI plus élevées peuvent être nécessaires pour les lignées cellulaires difficiles à transfecter.
Composants
Lentivirus TagRFP-LC3 :
un flacon contenant 25 µL de particules lentivirales à une concentration minimum de 3 x 10E8 unités infectieuses (IFU) par mL.
Pour obtenir des informations sur les titres spécifiques d'un lot, veuillez consulter “Titre viral” dans l'encart du produit ci-dessus.
Promoteur
EF-1 (facteur d'élongation 1)
Multiplicité d'infection (MOI)
MOI = Rapport entre le nombre de particules lentivirales infectieuses (IFU) et le nombre de cellules infectées.
Les valeurs de MOI typiques pour une efficacité de transduction et une intensité de signal élevées sont comprises entre 20 et 40. Pour cette cible, certains types cellulaires peuvent nécessiter des valeurs de MOI plus faibles (p. ex. : HT-1080, HeLa), tandis que d'autres peuvent nécessiter des valeurs de MOI plus élevées (p. ex. : cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), U2OS, cellules souches mésenchymateuses humaines (HuMSC)).
REMARQUE : La valeur de MOI doit être titrée et optimisée par l'utilisateur final pour chaque type cellulaire et chaque cible lentivirale afin d'atteindre l'efficacité de transduction et l'intensité du signal souhaitées.
un flacon contenant 25 µL de particules lentivirales à une concentration minimum de 3 x 10E8 unités infectieuses (IFU) par mL.
Pour obtenir des informations sur les titres spécifiques d'un lot, veuillez consulter “Titre viral” dans l'encart du produit ci-dessus.
Promoteur
EF-1 (facteur d'élongation 1)
Multiplicité d'infection (MOI)
MOI = Rapport entre le nombre de particules lentivirales infectieuses (IFU) et le nombre de cellules infectées.
Les valeurs de MOI typiques pour une efficacité de transduction et une intensité de signal élevées sont comprises entre 20 et 40. Pour cette cible, certains types cellulaires peuvent nécessiter des valeurs de MOI plus faibles (p. ex. : HT-1080, HeLa), tandis que d'autres peuvent nécessiter des valeurs de MOI plus élevées (p. ex. : cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), U2OS, cellules souches mésenchymateuses humaines (HuMSC)).
REMARQUE : La valeur de MOI doit être titrée et optimisée par l'utilisateur final pour chaque type cellulaire et chaque cible lentivirale afin d'atteindre l'efficacité de transduction et l'intensité du signal souhaitées.
Qualité
Évaluée par transduction de cellules HT-1080 à des valeurs de MOI de 20 et 40. Imagerie par fluorescence réalisée pour évaluer la localisation de la cible et l'efficacité de la transduction.
Informations légales
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Code de la classe de stockage
10 - Combustible liquids
Classe de danger pour l'eau (WGK)
WGK 2
Certificats d'analyse (COA)
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Notre équipe de scientifiques dispose d'une expérience dans tous les secteurs de la recherche, notamment en sciences de la vie, science des matériaux, synthèse chimique, chromatographie, analyse et dans de nombreux autres domaines..
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