HPLC de petites molécules

Pour obtenir les meilleurs résultats possibles lors d'une analyse de petites molécules par chromatographie liquide haute performance (HPLC), UHPLC ou LC-MS, il faut avant tout choisir les conditions les plus adaptées en termes de phase stationnaire et de phase mobile. La chimie de l'analyte est un paramètre essentiel lors du choix de la chimie de colonne la plus pertinente. D'autres aspects, tels que la vitesse d'analyse, la matrice des échantillons et le nombre de composés permettent de définir le matériau de base le plus approprié pour la phase stationnaire.

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Analyse HPLC de petites molécules

L'analyse des petites molécules par HPLC se fait le plus souvent selon un mode de séparation en phase inverse. Pour la séparation de composés polaires, on utilise également la chromatographie hydrophile (HILIC) et la chromatographie en phase normale, la méthode HILIC étant l'option privilégiée. Il est aussi possible de séparer les composés ioniques par séparation à échange d'ions, et les anions ou cations inorganiques par chromatographie d'échange d'ions (ou chromatographie ionique).

En guise de phase stationnaire, la colonne de HPLC est remplie de particules de silice entièrement poreuses, de particules de silice poreuses en surface uniquement, de particules polymères, ou est constituée d'une tige de silice monolithique. On peut également employer de l'oxyde d'alumine, des particules de zircone ou des particules de carbone. Le matériau constituant la phase stationnaire lors de la séparation de petites molécules a généralement une dimension de pores de l'ordre de 60 Å à 160 Å. En HPLC, la granulométrie de la phase stationnaire est typiquement comprise entre 3 µm et 5 µm ; en UHPLC, la granulométrie est plus faible, en général inférieure ou égale à 2 µm. La phase stationnaire peut être modifiée pour conférer différentes sélectivités à la colonne. La chimie de colonne la plus courante en chromatographie en phase inverse (RP) est la chaîne alkyle en C18. Toutefois d'autres modifications, telles que les chaînes en C30 et C8, les groupements phényle et pentafluorophényle, et une vaste gamme de modifications plus polaires, de même que des modifications conférant des propriétés d'échange d'ions ou des propriétés chirales, permettent de séparer quasiment tous les composés solubles dans un liquide. La phase mobile en RP-HPLC est généralement constituée d'un tampon aqueux ou d'eau, et de solvants organiques miscibles à l'eau du type acétonitrile ou méthanol.

Préparation d'échantillons pour HPLC

Les échantillons complexes ou à matrice chargée tels que les aliments, les boissons, les cosmétiques, les échantillons biologiques et les formulations pharmaceutiques à matrice complexe (comme les crèmes ou les sirops) nécessitent des protocoles de préparation d'échantillons efficaces, afin d'éliminer les constituants indésirables et d'extraire sélectivement l'analyte recherché. Cela est essentiel si la phase stationnaire a une très faible granulométrie, comme c'est le cas en UHPLC, où les particules ont une taille inférieure ou égale à 2 µm. Les méthodes de préparation d'échantillons couramment employées sont l'extraction liquide-liquide, l'extraction en phase solide (SPE) et, pour les échantillons biologiques, la précipitation des protéines en plus de la filtration. Outre l'élution sélective du composé cible et la pré-concentration, la préparation des échantillons a pour objectif principal de protéger la phase stationnaire de HPLC contre les colmatages dus à la matrice des échantillons. Les colonnes de HPLC à base de silice monolithique sont relativement tolérantes aux matrices et requièrent un niveau de préparation des échantillons bien moindre que les colonnes remplies de particules. 

Dérivatisation

Une dérivatisation est nécessaire pour certaines molécules, que ce soit avant (pré-colonne) ou après (post-colonne) la séparation par HPLC. La dérivatisation transforme les molécules en leurs dérivés ; cela permet d'améliorer la sensibilité ou la rétention chromatographique en HPLC. La dérivatisation nécessite des réactifs chimiques, aux propriétés physiques et chimiques particulières.

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