Protocole d'hybridation d'oligonucléotides

• Abréviations
• Matériel et fournitures d'hybridation d'ADN ou d'ARN
• Méthode d'hybridation d'ADN ou d'ARN
• Recettes de tampons d'hybridation d'ADN

Ce protocole permet d'hybrider deux oligonucléotides monocaténaires de séquences complémentaires (Figure 1). L'hybridation est facilitée par un chauffage suivi d'un refroidissement.

Figure 1. Exemple de réaction d'hybridation. La chaleur "casse" toutes les liaisons hydrogène, déstabilisant les structures secondaires présentes dans chaque oligonucléotide. Un refroidissement lent facilite ensuite l'hybridation, de nouvelles liaisons hydrogène se formant entre les séquences complémentaires.

Définitions et abréviations

EDTA : Acide éthylènediaminetétraacétique.

NaCl : Chlorure de sodium.

Trizma^® base : Nom commercial du Tris [tris(hydroxyméthyl)aminométhane].

Oligo : Abréviation d'oligonucléotide ou d'oligomère. Les oligonucléotides sont de courtes molécules d'ADN ou d'ARN monocaténaire qui doivent être hybridées (chauffées ou dénaturées) pour pouvoir se lier à un brin d'ADN ou d'ARN complémentaire et former une molécule double brin.

Hybridation de l'ADN : Cette page est consacrée à l'hybridation de tous les oligonucléotides. On utilise parfois le terme d'hybridation de l'ADN, mais le processus s'applique également à l'ARN. L'hybridation est l'opération qui consiste à chauffer puis à refroidir deux oligonucléotides monocaténaires de séquences complémentaires. La chaleur casse toutes les liaisons hydrogène tandis que le refroidissement permet la formation de nouvelles liaisons entre les séquences.

Matériel et fournitures d'hybridation d'ADN ou d'ARN

• Bloc chauffant ou thermocycleur
• Microtubes à centrifuger de 2 ml
• Pointes de pipette
• H₂O Milli-Q^®
• EDTA (réf. E9884)
• NaCl (réf. S3014)
• Trizma^® base (réf. 93362)
• Deux oligonucléotides monocaténaires de séquences complémentaires

Méthode d'hybridation d'ADN ou d'ARN

L'hybridation se déroule en deux grandes étapes : 1) la dissolution et 2) l'hybridation, sur un bloc chauffant ou un thermocycleur.

Dissolution des oligonucléotides

Bien que chaque oligonucléotide soit fourni dans une quantité rigoureusement mesurée, il convient, pour de meilleurs résultats, de vérifier ces quantités à l'aide d'un spectrophotomètre afin de s'assurer d'ajouter la même quantité de chaque oligonucléotide dans le mélange réactionnel.

• Dissoudre chaque oligonucléotide dans un volume de tampon d'hybridation (voir recettes ci-après) de façon à obtenir la même concentration de chacun d'eux.
• La concentration de chaque oligonucléotide doit être égale au double de la concentration souhaitée de l'oligonucléotide bicaténaire.

Exemple

La concentration souhaitée de l'oligonucléotide bicaténaire est de 50 µM.

1. Oligonucléotide 1 : livré avec une densité optique (OD) de 10,55 (312,6 µg, 49,9 nmol) ; vérifier la valeur OD mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre.
2. Oligonucléotide 2 : livré avec une valeur OD de 9,04 (279,7 µg, 45,9 nmol) ; vérifier la valeur OD mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre.
3. La solution mère de chaque oligonucléotide doit présenter une concentration 2 fois plus élevée que la concentration souhaitée de l'oligonucléotide bicaténaire, c'est-à-dire que chaque solution mère doit être de 100 µM.
   1. Pour l'oligonucléotide 1, ajouter 49,9 × 10 = 499 µl de tampon d'hybridation de façon à obtenir une solution mère de 100 µM.
   2. Pour l'oligonucléotide 2, ajouter 45,9 × 10 = 459 µl de tampon d'hybridation de façon à obtenir une solution mère de 100 µM.

* Il s'agit d'un calcul simplifié qui ne fonctionne que pour l'élaboration de solutions de 100 µM et qui est employé ici à seul titre d'exemple. Pour en savoir plus sur le calcul des différentes concentrations en oligonucléotides, consulter la page Handling Guidelines & Stability.

Hybridation des oligonucléotides

Sur bloc chauffant

1. Dans un microtube, mélanger des volumes égaux des oligonucléotides équimolaires.
2. Incuber le microtube à 95 °C pendant 5 minutes.
3. Laisser le microtube refroidir lentement jusqu'à la température ambiante (< 60 min).

Sur thermocycleur

Bien qu'un bloc chauffant soit approprié, un thermocycleur permet une meilleure reproductibilité du processus.

1. Dans un microtube à PCR, mélanger des volumes égaux des oligonucléotides équimolaires.
2. Utiliser le profil de température suivant :
   1. Chauffer à 95 °C et maintenir la température pendant 2 minutes.
      
   2. Refroidir à 25 °C en 45 minutes.
      
   3. Refroidir à 4 °C pour un stockage temporaire.
3. Centrifuger brièvement le microtube afin d'éliminer la condensation formée sur le couvercle.

Après la mise en œuvre du bloc chauffant ou du thermocycleur, l'oligonucléotide bicaténaire est prêt à être utilisé ou stocké. Pour en savoir plus sur la conservation des oligonucléotides, consulter la page Handling Guidelines & Stability.

Recettes de tampons d'hybridation d'ADN

Préparer tous les tampons avec de l'eau Milli-Q^®.

Composition du tampon d'hybridation (concentré 1 ×)

• Tris 10 mM, pH 7,5-8,0
• NaCl 50 mM
• EDTA 1 mM

Composition du tampon ligase (concentré 1 ×)

Ce tampon est généralement utilisé avec de l'ADN ligase T4.

• Tris-HCl 50 mM, pH 7,5
• MgCl₂ 10 mM
• ATP 1 mM
• DTT 10 mM

Composition du tampon kinase (concentré 1 ×)

Ce tampon est généralement utilisé avec de la polynucléotide kinase T4.

• Tris-HCl 70 mM, pH 7,6
• MgCl₂ 10 mM
• DTT 5 mM