T4455

TEV protéase

• Synonyme(s) : P1 protease, TEVp, Tobacco Etch Virus protease, rTEV
• Code UNSPSC : 12352204
• Nomenclature NACRES : NA.54

Propriétés

• Source biologique: microbial (Tobacco Etch virus)
• Niveau de qualité: 200
• Produit recombinant: expressed in E. coli
• Description: Contains both a histidine tag and a GST tag
• Forme: solution
• Activité spécifique: ≥3,000 units/mg protein
• Poids mol.: 27 kDa
• Technique(s): protein purification: suitable
• Adéquation: suitable for purification of HIS tagged recombinant proteins
• Application(s): genomic analysis
• Conditions d'expédition: wet ice
• Température de stockage: −20°C

Description

Description générale

La TEV protéase possède un domaine catalytique de la protéase NIa du virus de la gravure du tabac (Tobacco Etch Virus, TEV) qui correspond à un poids moléculaire de 27 kDa. Elle est unique, présente une grande spécificité et est active à basse température.

La protéase du virus de la gravure du tabac est un outil utile pour le retrait des étiquettes de fusion des protéines recombinantes.

Application

La TEV protéase a été utilisée pour éliminer l'étiquette histidine de la protéine kinase activée par les mitogènes 14 (MAPK14) recombinante, le fragment C-terminal de la connexine 43 (Cx43) et la δ1-pyrroline-5-carboxylate réductase d'Oryza sativa. Elle a également été employée dans l'élution de protéasomes purifiés à partir de lignées de cellules leucémiques humaines K562.

Actions biochimiques/physiologiques

La TEV protéase immobilisée sur une matrice de streptavidine-agarose est un outil efficace pour le clivage des protéines de fusion. La TEV protéase a également été utilisée dans une étude sur la dégradation protéolytique de la protéine nlrp1b pour l'activité de l'inflammasome.

La protéase du virus de la gravure du tabac (TEV) subit une autolyse, mais ses mutants sont résistants à l'autolyse. L'expression bactérienne d'une TEV protéase recombinante donne de mauvais rendements et une solubilité réduite. L'utilisation d'une protéine de fusion TEV protéase-protéine fluorescente verte permet de surmonter ces difficultés et trouve une application dans la recherche en génomique structurale.

La TEV protéase possède une séquence de reconnaissance de site de clivage stricte constituée de 7 acides aminés : Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly/Ser.

Caractéristiques et avantages

Cette enzyme a été optimisée et purifiée pour présenter une plus grande stabilité et une activité hautement spécifique dans une large plage de températures.

Propriétés physiques

Il s'agit d'une TEV protéase recombinante de 52 kDa modifiée contenant des étiquettes GST et His faciles à éliminer sur des milieux d'affinité au glutathion ou His-Select^®.

La TEV protéase est un domaine catalytique modifié de la protéase NIa du virus de la gravure du tabac (Tobacco Etch Virus, TEV). La TEV protéase est une protéase à cystéine hautement spécifique qui fait partie de la famille des peptidases C4.

Définition de l'unité

Une unité de TEV protéase clive plus de 85 % de 3 μg d'un substrat témoin en une heure, à pH 8,0 et à 30 °C.

Forme physique

2 mg/ml ou plus dans un mélange de Tris-HCl 25 mM (pH 8.0), de NaCl 50 mM, de TCEP 1 mM et de 50 % de glycérol

solution aqueuse de glycérol

Notes préparatoires

Protocole de clivage
Préparer un tampon de dialyse frais. Ce tampon doit être optimisé pour la solubilité de la protéine cible et ne contenir aucun inhibiteur de protéase. Ce tampon de dialyse doit également être compatible avec les procédés de purification en aval ; par exemple, il doit contenir une quantité minimale d'EDTA ou de DTT si une colonne HIS-Select^® est utilisée pour éliminer l'étiquette His clivée.
Exemple de tampon de dialyse approprié : Tris-HCl 25 mM (pH 8.0), NaCl 150 à 500 mM, β-mercaptoéthanol 14 mM.
Cette TEV protéase présente la même activité dans du NaCl 150 mM ou du NaCl 500 mM et de l'imidazole 400 mM.
Diluer l'échantillon contenant la protéine cible dans le tampon de dialyse à une concentration de 1 à 2 mg/ml. Cette étape est facultative ; elle doit être réalisée en cas d'agrégation de la protéine cible dans le tampon de dialyse. Garder une petite aliquote qui servira de témoin dans l'analyse par PAGE. Il est possible d'ajouter de l'EDTA à une concentration finale de 0,5 mM si la protéine cible est éluée sur une colonne HIS Select^™ et si l'EDTA est compatible avec la protéine cible.
Ajouter la TEV protéase à un rapport protéase:protéine cible de 1:100 (p/p) ou à raison de 10 000 unités (1 mg) de TEV protéase pour 100 mg de protéine cible. Il n'est pas nécessaire de calculer le rapport molaire. La TEV protéase peut être ajoutée directement à la protéine cible. Il n'est pas nécessaire de changer le tampon ou de diluer la TEV protéase. Le rapport optimal doit être déterminé empiriquement. Un rapport protéase:protéine cible (p/p) compris entre 1:50 et 1:200 doit constituer une plage efficace pour la plupart des protéines cibles.
Dialyser l'échantillon contre le tampon de dialyse à 4 °C pendant environ 16 heures. La dialyse a pour but d'éliminer l'imidazole ou le glutathion lorsqu'une colonne HIS-Select^® ou une colonne d'affinité au glutathion est utilisée pour éliminer l'étiquette clivée ou la TEV protéase après clivage.
En règle générale, 1 mg de TEV protéase clive plus de 90 % de 100 mg d'une protéine témoin à 4 °C et en 16 heures.

Informations légales

HIS-Select is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

HiScreen is a trademark of Cytiva

Informations sur la sécurité

• Code de la classe de stockage: 10 - Combustible liquids
• Classe de danger pour l'eau (WGK): WGK 2
• Point d'éclair (°F): Not applicable
• Point d'éclair (°C): Not applicable