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PCR quantitative

qPCR avec colorant SYBR Green

La PCR quantitative en temps réel (qPCR) utilise des molécules rapporteuses fluorescentes pour permettre la quantification des produits amplifiés. Comme dans la PCR classique, une matrice d'ADN, d'ADNc ou d'ARN est amplifiée, mais à chaque cycle, des signaux fluorescents sont contrôlés pour une quantification relative ou absolue. Cette technique est utile dans de nombreux domaines de la recherche, notamment l'analyse de l'expression génique, du génotypage, des micro-ARN, des variations génétiques et des protéines.  

Comment analyser les données de qPCR ?

La fluorescence des molécules rapporteuses est mesurée et quantifiée ; en général, ce sont soit des colorants (SYBR® Green, bromure d'éthidium) qui s'intercalent entre les bases sur l'ADN double brin, soit des sondes conçues pour se lier à une séquence spécifique (sondes Molecular Beacons, sondes TaqMan®) sur l'ADN.

Quantification relative des données de qPCR

Il existe deux grandes méthodes de quantification des données de qPCR. La quantification relative, méthode la plus courante, utilise la comparaison des Ct (ΔΔCt), qui permet de déterminer le différentiel d'expression ou d'abondance du gène cible dans l'échantillon, comparé à un gène témoin et normalisé avec le différentiel d'expression d'un gène de référence. Puisque les valeurs d'efficacité E sont différentes pour le gène cible et le gène de référence, cette méthode tient également compte des différences entre les valeurs E. Cette méthode est plus souvent employée dans l'analyse de l'expression génique.

Quantification absolue des données de qPCR

La seconde méthode, la quantification absolue, est plus courante en microbiologie environnementale et s'appuie sur la courbe étalon (SC pour "Standard Curve"). La méthode de la courbe étalon utilise une série de dilutions d'une concentration en matrice connue (N0) pour créer une courbe étalon en utilisant la régression linéaire du log(N0) en fonction du cycle seuil (Ct pour "Cycle threshold"). Cette courbe sert ensuite à calculer les concentrations en matrice de l'échantillon. Cette méthode repose sur l'hypothèse que la valeur d'efficacité de l'échantillon est identique à celle de l'étalon. 

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