Protocoles de sélection de colonies par criblage blanc/bleu
Identification de bactéries recombinantes
Le criblage blanc/bleu est une technique qui permet d'identifier rapidement et efficacement les bactéries recombinantes. Il s'appuie sur l'activité de la β-galactosidase, enzyme présente chez E. coli qui clive le lactose en glucose et en galactose.
Disruption du gène lacZ
La présence de lactose dans le milieu environnant active l'opéron lacZ chez E. coli. Cette activation entraîne à la production de l'enzyme β-galactosidase qui métabolise le lactose. La plupart des vecteurs plasmidiques portent un court segment du gène lacZ, qui contient les informations de codage des 146 premiers acides aminés de la β-galactosidase. Les souches d'E. coli hôtes utilisées sont des cellules compétentes contenant la mutation par délétion lacZΔM15. Lorsque le vecteur plasmidique est assimilé par ces cellules, un processus d'α-complémentation produit une β-galactosidase fonctionnelle.
Les vecteurs plasmidiques utilisés pour le clonage sont manipulés pour que ce processus d'α-complémentation serve de marqueur de recombinaison. La séquence lacZ du vecteur plasmidique présente un site de clonage multiple. Elle peut être coupée par des enzymes de restriction pour y insérer l'ADN étranger. Lorsqu'un vecteur plasmidique contenant l'ADN étranger est assimilé par la bactérie E. coli hôte, il n'y a pas d'α-complémentation et aucune β-galactosidase fonctionnelle n'est donc produite. Si l'ADN étranger n'est pas inséré dans le vecteur ou s'il y est inséré à un endroit autre que le site de clonage multiple, le gène lacZ du vecteur plasmidique complète la mutation par délétion du gène lacZ dans la bactérie E. coli hôte, permettant la production d'une enzyme fonctionnelle.
Comment fonctionne le criblage blanc/bleu ?
Pour le criblage des clones contenant un ADN recombinant, un substrat chromogène appelé X-gal est ajouté dans la boîte de gélose. Si de la β-galactosidase est produite, le X-gal est hydrolysé en 5-bromo-4-chloro-indoxyle qui se dimérise spontanément en un pigment bleu insoluble appelé 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo. Les colonies formées par les cellules non recombinantes apparaissent donc en bleu, tandis que celles formées par les cellules recombinantes sont de couleur blanche. Les colonies recombinantes d'intérêt peuvent être facilement prélevées et cultivées.
L'isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) est utilisé conjointement avec le X-gal pour le criblage blanc/bleu. L'IPTG est un analogue non métabolisable du galactose qui induit l'expression du gène lacZ. Il convient de signaler que l'IPTG n'est pas un substrat de la β-galactosidase, mais seulement un inducteur. Un criblage visuel nécessite un substrat chromogène comme le X-gal.
Figure 1.Représentation schématique d'un exemple de vecteur plasmidique pouvant être utilisé pour un criblage blanc/bleu.
Figure 2.Représentation schématique d'une procédure de criblage blanc/bleu classique.
Produits à utiliser pour un criblage blanc/bleu
Protocoles de criblage blanc/bleu
L'ensemble du protocole de criblage blanc/bleu se déroule en 3 grandes étapes :
- Ligature : ligature de l'ADN étranger dans le site de clonage multiple du vecteur plasmidique
- Transformation bactérienne : introduction du vecteur plasmidique contenant l'insert d'ADN étranger dans les cellules d'E. coli compétentes
- Criblage : criblage blanc/bleu permettant d'identifier les colonies de bactéries recombinantes
Ligature
Nous proposons les vecteurs d'expression prêts à l'emploi suivants, qui peuvent servir à créer des systèmes d'expression stable ou transitoire. Ces produits de fusion à étiquette FLAG ont des origines de réplication qui permettent leur propagation dans les bactéries et les cellules de mammifères.
Matériel requis
Configuration de la réaction pour la ligature
- Ajouter tous les composants ci-dessus dans un tube réactionnel propre.
- Incuber pendant 30 minutes à 25 °C (étape réalisable dans un thermocycleur).
- Purifier l'ADN sur la colonne de purification de produits de PCR et l'éluer avec environ 50 µl.
- Transfecter 0,1 à 10 ng du produit de ligature dans des cellules chimio- ou électro-compétentes compatibles avec le vecteur.
Transformation bactérienne
Il est très important de disposer d'un plasmide de haute qualité pour la transformation bactérienne. Les kits suivants permettent d'isoler et de purifier un plasmide de haute qualité adapté à la transformation de bactéries.
Le protocole de transformation de cellules bactériennes chimio- ou électro-compétentes est détaillé ici.
Criblage
Nous proposons un choix de substrats chromogènes qui facilitent le criblage des bactéries recombinantes. Certains produits peuvent être étalés sur des boîtes de gélose LB (protocole de criblage no 1), tandis que d'autres sont incorporés dans le milieu microbien (protocole de criblage no 2). Ils sont utilisés conjointement avec de l'IPTG dès que les circonstances l'exigent. Les deux protocoles de criblage sont présentés ci-dessous.
Protocole de criblage no 1 (produits B6650, 16658, B2904, B3928, 16669, B8931)
- À l'aide d'un étaleur stérile, étaler 40 µl ou une quantité appropriée de solution mère de substrat chromogène et 10 µl de solution d'IPTG sur des boîtes de gélose LB (le produit B3928 ne nécessite pas l'ajout d'IPTG puisqu'il en contient déjà).
- Il convient de prévoir des boîtes témoins avec et sans antibiotique.
- Laisser les boîtes sécher dans une chambre à flux laminaire avec les couvercles légèrement ouverts.
- À l'aide d'un étaleur stérile, étaler 10 à 100 µl de cellules d'E. coli transfectées sur les boîtes de gélose LB.
- Incuber les boîtes à 37 °C pendant 24 à 48 heures.
- Des colonies bleues et blanches apparaissent à la surface de la gélose. Sélectionner les cellules recombinantes des colonies blanches pour les mettre en culture.
Protocole de criblage no 2 (produits S7313, S9811, C4478)
- Préparer une gélose LB en versant une quantité appropriée de milieu en poudre, de gélose et d'eau dans une fiole stérile. À défaut, peser une quantité appropriée de mélange C4478 et la verser dans de l'eau dans une fiole stérile.
- Ajouter 300 mg/l des produits S7313 et S9811, et 500 mg/l de citrate d'ammonium ferrique (produit F5879) dans le milieu avant autoclavage. Sauter cette étape si le produit C4478 est utilisé.
- Autoclaver le milieu et le refroidir juste assez pour pouvoir manipuler la fiole.
- Ajouter une concentration appropriée de l'antibiotique choisi.
- Verser environ 25 à 30 ml de la gélose LB dans des boîtes stériles et laisser prendre avec les couvercles légèrement ouverts.
- À l'aide d'un étaleur stérile, étaler 10 à 100 µl de cellules d'E. coli transfectées sur les boîtes de gélose LB.
- Incuber les boîtes à 37 °C pendant 24 à 48 heures.
- Des colonies bleues et blanches apparaissent à la surface de la gélose. Sélectionner les cellules recombinantes des colonies blanches pour les mettre en culture.
Figure 3.Sélection blanc/bleu de bactéries recombinantes sur substrat X-gal.
Limites du criblage blanc/bleu
- Le test blanc/bleu n'est qu'une méthode de criblage, et non une technique de sélection.
- Il peut arriver que le gène lacZ présent dans le vecteur ne soit pas fonctionnel et ne produise pas de β-galactosidase. La colonie correspondante apparaîtra donc en blanc bien qu'elle ne soit pas recombinante.
- Même si une petite séquence d'ADN étranger peut être insérée dans le site de clonage multiple et modifier le cadre de lecture du gène lacZ, cela donnera des colonies blanches faussement positives.
- De petites séquences insérées dans le cadre de lecture du gène lacZ peuvent donner des colonies bleu clair équivoques, car la β-galactosidase n'est que partiellement inactivée.
Références
Pour continuer à lire, veuillez vous connecter à votre compte ou en créer un.
Vous n'avez pas de compte ?