Détermination de l'oxydation des phospholipides par spectroscopie UV/VIS - Lipides polaires Avanti^®

Définition

Le pourcentage d'oxydation d'un phospholipide peut être déterminé par la loi de Beer en calculant la concentration en phospholipide peroxydé à partir de son absorbance à 234 nm.

Champ d'application

Applicable à tous les phospholipides insaturés.

Appareillage

• Spectrophotomètre UV/VIS
• Cuvette à échantillon en quartz pour mesure UV HELLMA (QS 1.000)
• Lingettes Kimwipe
• Tubes en verre jetables

Réactifs

• Éthanol (200 proof, anhydre, USP)
• Eau désionisée
• 16:0 PC (DPPC)

Protocole

1. Préparation de l'échantillon de DPPC. Préparer un minimum de 3 ml d'une solution de DPPC à 1 mg/ml dissous dans un mélange éthanol/eau DI (9/1).
2. Préparation de l'échantillon. Préparer un minimum de 3 ml d'une solution d'échantillon de phospholipide à 1 mg/ml dissous dans un mélange éthanol/eau DI (9/1).
3. Analyse du blanc. Le blanc (bruit de fond) correspond au solvant utilisé pour dissoudre les échantillons de phospholipide.
   • Rincer trois fois la cuvette à échantillon avec le solvant pour retirer les éventuels contaminants résiduels encore présents dans la cuvette.
   • Remplir la cuvette aux 3/4 avec la référence.
   • Essuyer avec une lingette Kimwipe toutes les empreintes digitales et les contaminants présents sur l'extérieur de la cuvette à échantillon.
   • Insérer la cuvette à échantillon dans le spectrophotomètre et analyser le spectre du blanc.
4. Analyse de l'échantillon de DPPC.
   • Verser le solvant blanc présent dans la cuvette à échantillon.
   • Remplir la cuvette à échantillon aux 3/4 avec la solution d'échantillon de DPPC.
   • Retirer les empreintes digitales présentes sur l'extérieur de la cuvette à échantillon.
   • Insérer la cuvette à échantillon dans le spectrophotomètre et analyser le spectre du DPPC.
5. Analyse de l'échantillon.
   • Retirer l'échantillon de DPPC de la cuvette à échantillon.
   • Rincer trois fois la cuvette à échantillon avec le solvant pour retirer les éventuels résidus de DPPC encore présents dans la cuvette.
   • Remplir la cuvette à échantillon aux 3/4 avec l'échantillon de phospholipide.
   • Retirer les empreintes digitales présentes sur l'extérieur de la cuvette à échantillon. Insérer la cuvette à échantillon dans le spectrophotomètre et analyser le spectre de l'échantillon.
   • Soustraire du spectre de l'échantillon le spectre du DPPC, et enregistrer la valeur de l'absorbance (densité optique, DO) de l'échantillon de phospholipide à 234 nm.

Calculs

Concentration en lipide peroxydé (D) = A/(B*C)
A = Valeur de l'absorbance (densité optique, DO) à 234 nm
B = Coefficient d'extinction en (DO*ml)/(mmol*cm) (27 000 pour le lipide peroxydé)
C = Chemin optique en cm
Pourcentage d'oxydation = D/E * 100
D = Concentration en lipide peroxydé en mg/ml
E = Concentration de l'échantillon de lipide = 1,0 mg/ml

Références bibliographiques

1. Kim R, LaBella F. 1987. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid Res. 28:1110-1117.