Comptage des cellules et analyse de la santé cellulaire

Il est nécessaire de compter les cellules en culture afin de suivre leur temps de doublement et de les quantifier avant les expériences ou les procédés de fabrication. Les cellules cultivées requièrent une surveillance de routine non seulement pour contrôler leur prolifération, mais aussi pour connaître leur viabilité, leur cytotoxicité et pour effectuer d'autres mesures concernant leur santé. Le test est choisi en fonction du type de cellules en culture, de l'application de l'étude et du débit recherché. Il est critique de quantifier, ou compter, les cellules cultivées avant une sous-culture ou une utilisation aval dans des transfections, des études génomiques, une cryopréservation ou d'autres manipulations.    

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Comptage manuel des cellules

Les chambres de comptage cellulaire comme l'hémocytomètre, dotées de quadrillages Neubauer, sont des dispositifs courants de comptage manuel/visuel des cellules. Une petite aliquote de suspension cellulaire est placée dans la chambre d'un dispositif de précision en verre quadrillé, où elle se disperse par capillarité sur le quadrillage gravé. Les cellules sont visualisées au microscope et comptées à l'aide d'un compteur manuel. Le volume prédéfini de la chambre et le système de quadrillage permettent de calculer la concentration des cellules. Il existe des systèmes d'imagerie qui permettent d'automatiser le processus de comptage.

Comptage automatisé des cellules

Beaucoup d'appareils de comptage automatisé reposent sur les mêmes principes et les mêmes colorants de comptage visuel que l'hémocytomètre. Contrairement aux compteurs automatisés qui s'appuient sur la reconnaissance d'objets, les dispositifs basés sur le principe de Coulter sont devenus populaires grâce à leur facilité d'utilisation et leur précision. Les compteurs Coulter pompent les suspensions cellulaires au travers d'un capteur qui détecte les cellules grâce à la variation de la résistance électrique. Cela assure une détection plus fiable des cellules, même pour les petites cellules, et des comptages d'une grande exactitude. Les modèles portatifs (similaires à une pipette) permettent de compter les cellules directement sous la hotte de culture.

Tests de viabilité cellulaire

Synthèse d'ADN : Certains tests de prolifération cellulaire reposent sur la surveillance de la synthèse active d'ADN dans les cellules. La réplication de l'ADN peut être mesurée par incorporation de nucléosides modifiés, comme la 3H-thymidine radioactive ou la bromodésoxyuridine (BrdU) non radioactive, qui sont détectés à l'aide d'un anticorps.

Activité métabolique : Les tests calorimétriques qui mesurent l'activité métabolique permettent d'analyser la prolifération cellulaire, la viabilité des cellules et la cytotoxicité. La réduction de sels de tétrazolium tels que le MTT, le XTT et le WST-1 en composés colorés du type formazan ne s'opère que dans les cellules métaboliquement actives. La présence d'ATP est aussi un indicateur de l'activité métabolique. Dans le test au gène rapporteur de la luciférase de luciole, l'ATP produit par les cellules en division sert à oxyder de la D-luciférine, ce qui génère une lumière bioluminescente qui sert de signal de lecture.

Exclusion de colorant : La coloration au bleu de trypan est couramment utilisée pour le comptage des cellules viables. Le principe de cette méthode repose sur le fait que les cellules vivantes n'incorporent pas le colorant, alors que les cellules mortes intègrent le colorant et apparaissent bleues au microscope.

Tests de viabilité cellulaire basés sur la fluorescence : Le marquage au 5(6)-carboxyfluorescéine diacétate N-succinimidyl ester (CFSE) est une méthode populaire de mesure du nombre de cycles complets de division cellulaire au sein d'une population de cellules. Un autre colorant perméable aux membranes, la calcéine AM, n'est pas fluorescent en lui-même, mais émet une forte fluorescence verte après hydrolysation dans les cellules viables. En revanche, l'iodure de propidium (IP), un colorant nucléaire, ne peut atteindre le noyau qu'en passant à travers la membrane détériorée des cellules mortes. Comme la calcéine AM et l'ADN-IP peuvent tous deux être excités par de la lumière à 490 nm, il est possible de visualiser simultanément les cellules mortes et les cellules vivantes à l'aide d'un microscope à fluorescence avec une longueur d'onde d'excitation unique.