Viruskonzentration mittels Ultrafiltration

• Virusisolierung, -vermehrung und -charakterisierung
• Allgemeine Methoden zur Virusvermehrung
• Viruskonzentration für hochkonzentrierte Virusbestände
• Viruskonzentration mit Amicon^®-Ultra-Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration
• Schlussfolgerungen
• Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration

Virusisolierung, -vermehrung und -charakterisierung

Abbildung 1. Ultrafiltration für die Konzentration von Viren. Flüssigkeit gelangt durch den Membranfilter, wohingegen große Viruspartikel zurückgehalten werden.

Methoden zur Virusisolierung und -vermehrung sind wichtig bei der Forschung, bei der Impfstoffherstellung und bei diagnostischen Arbeitsabläufen. Labore, die Grundlagenforschung betreiben, verwenden Virusbestände zur Untersuchung von Virenbiologie und -pathogenese. Für die Impfstoffherstellung ist die Vorbereitung von Viren in kleinem und großem Umfang erforderlich. Obwohl die meisten diagnostischen Labore mittlerweile Ansätze ohne Kultivierung für die Diagnose von Viruserkrankungen nutzen, bleibt die Virusisolierung in der Zellkultur eine nützliche Herangehensweise, wenn lebensfähige Isolate benötigt werden, wenn lebensfähige und nicht lebensfähige Viren unterschieden werden müssen und wenn kulturbasierte Methoden schnellere Ergebnisse liefern als Methoden ohne Kultivierung.

Viren können in Zellkulturen vermehrt werden, um Virusbestände zu erhalten. Kultivierte Zellen werden mit einem Virusbestand aus Saatvirus, einer kommerziell erhältlichen Quelle oder infiziertem Gewebe inokuliert. Nach der Inkubation werden die infizierten Zellen lysiert, um Viruspartikel zu gewinnen, oder die abgegebenen Viren werden direkt aus den Zellüberständen gewonnen. Der Virusbestand wird dann titriert, aliquotiert und für die spätere Verwendung bei –80 °C gelagert.

Bei der Isolierung von Viren aus klinischen Proben kommen außerdem Zellkulturen für die Virusvermehrung zur Anwendung. Die klinischen Proben werden mittels Probenhomogenisierung und -extraktion in einem flüssigen Medium vorbereitet, welches dann zentrifugiert und zur Inokulation der Zellkulturen verwendet wird.

Für hochkonzentrierte Virusbestände ist es notwendig, aufgereinigte Viruspartikel zu konzentrieren. Amicon^®-Ultra- und Centricon^®-Plus-Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration mit Membranen aus regenerierter Zellulose können verwendet werden, um Virionen und Viruslösungen zu konzentrieren (Abbildung 1). Das folgende Protokoll bezieht sich auf die Anwendung von Amicon^®- und Centricon^®-Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration bei der Konzentration von drei gängigen Virustypen: Lentiviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren (AAV).

Allgemeine Methode zur Virusvermehrung

1. Packen der Zellen: Die Wirtszellen wurden ausplattiert, um eine Konfluenz von 80 bis 85 % zu erreichen.
2. Transfektion: Die Zellen wurden mit lebensfähigen Viruspartikeln infiziert.
3. Gewinnen der Viren: Je nach Virus wurden zur Aufreinigung der rekombinanten Virionen entweder der Zellüberstand oder pelletierte Zellen oder beides verwendet. Vier Einfrier-/Auftauzyklen wurden angewendet, damit die Zellen die Viren abgeben. Die Zelltrümmer wurden dann mittels Zentrifugation vom Zelllysat getrennt. 
   
4. Aufreinigen der Viren: Die Viren wurden mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation oder Säulen-/Membranchromatographie aus dem Zelllysat aufgereinigt.
5. Die aufgereinigten Viruslösungen wurden konzentriert und der Puffer wurde mittels passiver Dialyse, Diafiltration oder Zentrifugen-Ultrafiltration mit Amicon^® Ultra und Centricon^® Plus 70 Einheiten gegen eine geeignete Lagerungslösung ausgetauscht.

Viruskonzentration für hochkonzentrierte Virusbestände

Zur Herstellung hochkonzentrierter Virusbestände können die aufgereinigten Viren mittels Zentrifugen-Ultrafiltration konzentriert werden. Die richtige Auswahl von Ausrüstung, Membranmaterial, Molekulargewichtsgrenzen oder -grenzwerten, Zentrifugendrehzahl, Zentrifugierdauer und Pufferzusammensetzung ist für eine hohe Rückgewinnungsrate von infektiösen Viruspartikeln ausschlaggebend. Amicon^®-Ultra-Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration weisen festgelegte nominale Molekulargewichtsgrenzen (NMWL; Nominal Molecular Weight Limits) auf, die durch ihre jeweilige Filtermembran definiert sind. Amicon^®-Ultra-Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration mit Ultracel^®-Membran (NMWL: 50 kDa) wurden zum Konzentrieren von Adenovirus- und AAV-Lösungen verwendet. Für die Lentivirus-Konzentration wurden Einheiten mit sowohl 50-kDa- als auch 100-kDa-NMWL-Membranen verwendet.

Zu berücksichtigende Faktoren für die Auswahl der Ultrafiltrationsmethode sowie der nominalen Molekulargewichtsgröße der Membran:

1. Viruspartikelgröße: Die Größe kann auf Grundlage von veröffentlichten Quellen oder anhand von Messtechniken wie Mikroskopie, Laserbeugung oder dynamischer Lichtstreuung geschätzt werden.
2. Größe der wichtigsten Trennungsziele in der Lösung: Die Größe der Proteine, Antikörper, Wirkstoffe, chemischen Stoffe und sonstigen Partikel, die getrennt werden müssen, beeinflusst die Auswahl der Membrangröße.
3. Probenvolumen: Verarbeitungsmengen von ≤ 0,5 ml bis 70 ml sind mit Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration (cUF; centrifugal UltraFiltration) kompatibel.

Um Viruspartikel zurückzuhalten, muss der Molekulargewichtsgrenzwert der Filtermembran kleiner sein als der Partikel (etwa halb so groß wie das Molekulargewicht des Viruspartikels), jedoch groß genug, dass kleinere Komponenten herausgefiltert werden können
(Tabelle 1).

Tabelle 1. NMWL-Auswahl für Ultrafiltrationsmembran auf Grundlage der Viruspartikelgröße.

NMWL (kDa) der Ultrafiltrationsmembran	Nominale Porengröße (nm)	Empfohlener nominaler Größenbereich für das Zurückhalten bei der Ultrafiltration
		Durchmesser (nm)		Molekulargewicht (kDa)
		Minimum	Maximum	Minimum	Maximum
3	0,3	1	1,5	6	20
10	1	3	9	20	90
30	3	9	15	60	180
50	5	15	30	100	300
100	10	30	90	200	900

Viruskonzentration mit Amicon^®-Ultra-Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration

Tabelle 2 zeigt Ergebnisse für Adenovirus-, Lentivirus- und AAV-Konzentrationen von sowohl rohem Zelllysat als auch von chromatographisch aufgereinigten Viren. Die Viruspartikel wurden mittels Amicon^® Ultra Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration effektiv auf hohe Titer mit hoher Rückgewinnungsrate konzentriert.

Tabelle 2. Viruskonzentration mittels Ultrafiltrationseinheiten. Aufgrund der potenziellen Virusaggregation empfiehlt es sich, die Viren nicht auf mehr als 1.013 Partikel/ml zu konzentrieren.

Ausgangsprobe	Einheit	Ausgangsvirustiter	Ausgangsvolumen (ml)	Konzentrationsfaktor	Zentrifugierdauer bei 1.500 x g (min)	Rückgewinnung (%)
Adenovirus in rohem Zelllysat	Amicon® Ultra-4, 50 kDa	1 x 108	4	27X	20	> 100
Aufgereinigtes Adenovirus, in 1-M-Salzpuffer	Amicon® Ultra-4, 50 kDa	1 x 108	4	45X	10	85
AAV in rohem Zelllysat	Amicon® Ultra-4, 50 kDa	2 x 107	4	20X	35	50
AAV in rohem Zelllysat	Amicon® Ultra-15, 50 kDa	2 x 107	10	25X	45	76
AAV verdünnt in 100 mM Tris-Puffer und 250 mM NaCl-Puffer	Amicon® Ultra-4, 50 kDa	5 x 106	4	20X	20	100
Lentivirus in Zellkulturüberstand	Amicon® Ultra-4, 100 kDa	9 x 104	4	100X	30	> 100
Lentivirus in Zellkulturüberstand	Amicon® Ultra-4, 50 kDa	9 x 104	4	100X	30	93
Lentivirus in Zellkulturüberstand	Centricon Plus-70, 100 kDa	8 x 103	65	80X	30	81

Es bleibt zu beachten, dass die meisten Viren weder effizient konzentriert noch in Puffern mit niedrigem Salzgehalt gelagert werden können. Die Zentrifugalkonzentration eines Virus in einer Salzlösung von < 250 mM führt zu einer Virusaggregation und verringerten Infektiosität.

Ein konzentrierter Virusbestand kann durch 0,22-µm-Filter sterilisiert werden. Für Volumen < 0,5 ml eigenen sich Ultrafree^®-MC-GV-Filtereinheiten.

Schlussfolgerungen

Wir haben als schnelle und kostengünstige Möglichkeit zum Erreichen hoher Virustiter eine Methode zur Validierung der Ultrafiltration mittels Amicon^®-Ultra- und Centricon^®-Plus-Zentrifugeneinheiten entwickelt. Mit dieser können Sie Viren aus Zellkulturüberständen, Zelllysaten und weitere Quellen konzentrieren. Nach der Konzentration können Sie den Virusbestand mittels Ultrafree^®-Filtereinheiten sterilisieren. Für eine höchstmögliche Rückgewinnungsrate von infektiösen Viruspartikeln müssen Ultrafiltrationseinheit, Membranfilter, Molekulargewichtsgrenzwert (MWCO; Molecular Weight Cut-Off) sowie Zentrifugendrehzahl und Zentrifugierdauer korrekt ausgewählt werden.

Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration

Nominale Molekulargewichtsgrenze (NMWL) der Einheit (kDa)	Amicon®-Ultra-Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration				Centricon®-Plus-70-Zentrifugeneinheiten
	0,5 ml	2 ml	4 ml	15 ml	15–70 ml
3	UFC5003		UFC8003	UFC9003	UFC7003
10	UFC5010	UFC2010	UFC8010	UFC9010	UFC7010
10 (IVD*)			UFC4010D*	UFC9010D*
30	UFC5030	UFC2030	UFC8030	UFC9030	UFC7030
50	UFC5050	UFC2050	UFC8050	UFC9050
100	UFC5100	UFC2100	UFC8100	UFC9100	UFC7100

* Registriert für die IVD-Anwendung