Pulldown-Assays

In Pulldown-Assays wird ein Proteinkomplex durch Adsorption des Komplexes an Beads isoliert. Immobilisierte Liganden auf den Beads binden spezifisch an einen Bestandteil des Komplexes, entweder über ein Affinitäts-Tag (z. B. GST, Histidin, Maltose-bindendes Protein usw.) oder einen Antikörper. Pulldown-Assays werden häufig für die Isolierung von Komplexen in geringen µg-Mengen verwendet, vor allem um einzelne Untereinheiten zu identifizieren. Sie werden auch zur Isolierung von Materialien für begrenzte funktionelle Studien verwendet, für die Herstellung größerer Mengen (mg) jedoch, erscheinen andere Verfahren als besser geeignet. Die Komponenten des eingefangenen Komplexes werden häufig mittels Massenspektrometrie analysiert, um die Untereinheiten zu identifizieren.

Pulldown-Assays sind wichtige Instrumente für die Lokalisation von Protein-Protein-Wechselwirkungsnetzwerken. Sie wurden bereits erfolgreich auf globaler Ebene eingesetzt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in einer Reihe von Organismen (z. B. Hefe, E. coli, C. elegans) zu lokalisieren. Genetische Ansätze mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System (Y2H) und ähnliche Technologien sind nützliche Ergänzungen zur Isolierung von Multiproteinkomplexen. Falsch-positive Ergebnisse sind ein großes Problem bei der Lokalisation von Protein-Protein-Wechselwirkungen im globalen Maßstab. Daher ist es sinnvoll, zusätzlich zu den entsprechenden Kontrollversuchen sowohl komplexe Isolations- als auch Y2H-Versuche unabhängig voneinander durchzuführen, um die Datensätze zu validieren. Anschließend kann eine Verifizierung in einer in-vivo-ähnlichen Umgebung erfolgen.

In diesem Beitrag werden drei verschiedene Pulldown-Verfahren für die Isolierung kleiner Mengen von Komplexen zum Zweck der Identifizierung von Komplexkomponenten behandelt. Bei zwei dieser Verfahren wird eine (bekannte oder vermutete) Komponente des Komplexes mit einem Affinitäts-Tag versehen. Beim dritten Verfahren, der Co-Immunpräzipitation, wird ein Antikörper verwendet, der gegen eine (bekannte oder vermutete) Komponente gerichtet ist. Bei allen drei Verfahren werden Beads mit geeigneten Liganden verwendet, um den Komplex aus einer rohen biologischen Probe herauszulösen. Eine Übersicht über die Vor- und Nachteile der verschiedenen Verfahren ist in Tabelle 2.1 dargestellt.

Tabelle 2.1 Vor- und Nachteile verschiedener Pulldown-Assays für die Rückgewinnung von Proteinkomplexen

Methode	Vorteile	Nachteile
Affinitäts-Pulldown	Generisch. Fähigkeit zur Aufreinigung gering abundanter Proteinkomplexe	Die Gegenwart eines Protein-Tags kann die Ergebnisse beeinflussen. Wettbewerb mit dem endogenen Komplex
Tandem Affinity Purification (TAP)	Generisch. Fähigkeit zur Aufreinigung gering abundanter Proteinkomplexe. Durchgehende Verwendung milder Bedingungen	Die Gegenwart eines Protein-Tags kann die Ergebnisse beeinflussen. Wettbewerb mit dem endogenen Komplex
Co-Immunpräzipitation	Erfordert keine Klonierung und heterologe Expression. Schnell, wenn Antikörper vorhanden sind	Nicht generisch – erfordert Zugang zu spezifischen Antikörpern

Affinitäts-Pulldown-Assay

Affinitäts-Pulldown-Assays sind für die Isolierung und anschließende Identifizierung von Proteinkomplexen gut etabliert. GST-Pulldown-Assays umfassen Affinitäts-Aufreinigungen eines oder mehrerer unbekannter Proteine aus einer biologischen Probe mittels eines GST-markierten Bait-Proteins. Das Grundprinzip besteht darin, dass das GST-markierte Bait-Protein an seine Partner bindet und der resultierende Komplex auf Beads mit immobilisiertem Glutathion eingefangen wird. Eine Kontrolle dient dazu, falsch-positive Ergebnisse zu identifizieren, die in Abwesenheit eines Bait-Proteins an GST binden. Bei der Kontrolle kann es sich entweder um Lysat aus separat transformierten Zellen handeln, die GST exprimieren (nicht das Bait-Fusionsprotein), oder um Lysat aus nicht transformierten Zellen, denen GST zugesetzt wird. Die Planung geeigneter Kontrollen ist für den Versuch von hoher Bedeutung.

Ein gängiges Assayformat ist das Herunterzentrifugieren der Beads und der gebundenen Proteine mit einer Zentrifuge, daher der Begriff "Pulldown". Das Prinzip ist in Abbildung 2.4 dargestellt.

Abbildung 2.4. Skizzierung eines GST-Pulldown-Versuchs. Im Verfahren auf der rechten Seite ist der Kontrollversuch dargestellt. In diesem Beispiel wurden zwei Proteine (violett und rot) mittels SDS-PAGE als Wechselwirkungspartner mit dem Bait-Protein (linke Bahn) identifiziert. Ein weiteres Protein (grün) wurde herunterzentrifugiert, aber von der Kontrolle (rechte Bahn) als falsch positiv identifiziert (GST-Binder).

GST-Pulldown-Assay mittels GST-SpinTrap-Aufreinigungsmodul

Materialien

GST-SpinTrap-Aufreinigungsmodul mit 10× PBS, MicroSpin-Säulen, Verdünnungspuffer und reduziertem Glutathion

Pufferherstellung

1× PBS: Für die Herstellung von 1× PBS das mitgelieferte 10× PBS zehnfach mit sterilem Wasser verdünnen. Bei 4 °C lagern. Die Endkonzentration beträgt 10 mM Phosphat, 2,7 mM KCl, 140 mM NaCl, pH 7,3.

Verdünnungspuffer  Wie geliefert, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0

Elutionspuffer:   10 mM reduziertes Glutathion, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Um den Elutionspuffer vorzubereiten, das gesamte Volumen von 50 ml des mit dem Modul gelieferten Verdünnungspuffers in die Flasche mit dem reduzierten Glutathion (0,154 g) gießen. Bis zur vollständigen Auflösung schütteln. 1 bis 20 ml Aliquote bei -20 °C aufbewahren.

Durchführung

Die für den Nachweis von Proteinkomplexkomponenten erforderliche Lysatmenge variiert. Ein nützlicher Ausgangspunkt ist ein Lysatvolumen, das 106-107 Gewebekulturzellen entspricht. Eine zweite Säule einsetzen, um einen Kontrollversuch mit einem Zelllysat nur mit GST (ohne Bait-Fusionsprotein) durchzuführen.

1. Die Glutathion-Sepharose 4B in jeder SpinTrap-Säule durch vorsichtiges Vortexen resuspendieren.
2. Die Säulenkappen mit einer Viertelumdrehung lösen. Bodenverschlüsse entfernen (und aufbewahren).
3. Jede Säule in ein sauberes 1,5- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen einsetzen. 1 min bei 735 × g zentrifugieren.
4. Den Puffer aus allen Zentrifugenröhrchen verwerfen und die Bodenverschlüsse wieder anbringen.
5. Bis zu 600 µl Lysat, welches das GST-Fusionsprotein (Bait) enthält, auf eine Säule auftragen. Als Kontrolle wird das gleiche Volumen an Lysat mit GST (ohne Bait-Protein) verwendet.
6. Jede Säule fest verschließen und durch vorsichtiges, wiederholtes Umdrehen mischen. Bei 4 °C 2 h inkubieren.
7. Die oberen Kappen und Bodenverschlüsse entfernen (und aufbewahren). Jede Säule in ein sauberes, mit Etikett versehenem 1,5- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben.
8. 1 min bei 735 × g zentrifugieren, um den Durchfluss aufzufangen. Den Durchfluss für die Analyse mittels SDS-PAGE aufbewahren.
9. Jede Säule in ein sauberes, mit Etikett versehenem 1,5- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben.
10. 600 µl 1× PBS-Waschpuffer auf jede Säule geben und den Zentrifugationsvorgang wiederholen. Falls gewünscht, weitere 600-µl-Waschvorgänge mit 1× PBS durchführen. Damit gute Ergebnisse erzielt werden, ist es wichtig, diesen Schritt zu optimieren.
11. 100 bis 200 µl Elutionspuffer auf jede Säule geben. Die oberen Verschlusskappen und Bodenverschlüsse wieder anbringen. 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Damit gute Ergebnisse erzielt werden, ist es wichtig, diesen Schritt zu optimieren.
12. Die oberen Verschlusskappen und Bodenverschlüsse entfernen und entsorgen und jede Säule in ein sauberes 1,5- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen setzen.
13. Alle Säulen zentrifugieren und die Eluate sammeln. Mittels SDS-PAGE analysieren.

Die Auswahl der Pufferbedingungen könnte die Protein-Protein-Wechselwirkungen beeinflussen.

Es ist erforderlich, die Waschbedingungen für jeden Versuch zu optimieren.

Eine schlechte Wiederfindung eines Komplexes kann darauf zurückzuführen sein, dass das Affinitäts-Tag nicht für die Bindung an den Affinitätsliganden zugänglich war, als der Komplex gebildet wurde. In solchen Fällen empfiehlt es sich, die Markierungsstelle zu wechseln (z. B. vom N- zum C-Terminus) oder eine andere komplexe Komponente zu markieren.

Abhängig vom Maßstab und erforderlichem Durchsatz stehen verschiedene Optionen für GST-Pulldown-Assays zur Verfügung (siehe "Materialien" am Ende dieses Beitrags).

Tandem Affinity Purification (TAP)

Die TAP-Methode wird mit oder ohne Modifikationen für die Aufreinigung und Identifizierung von Komplexen aus Hefe, Trypanosomen, Fruchtfliegen, Menschen und Pflanzen verwendet.

TAP unterscheidet sich durch zwei aufeinanderfolgende Chromatographieschritte zur Isolation der Proteinkomplexe vom zuvor beschriebenen Ansatz. Der Grund für die Verwendung von zwei Affinitätsschritten liegt darin, die Spezifizität des Aufreinigungsverfahrens zu erhöhen und damit die Anzahl falsch-positiver Ergebnisse zu verringern. Außerdem werden in diesem Verfahren milde Bedingungen eingesetzt, um die Integrität des Komplexes zu erhalten und die Ausbeute zu maximieren. Das Verfahren wurde bereits in vielen Fällen erfolgreich angewandt.

Das Grundprinzip der TAP ist in Abbildung 2.5 dargestellt. Ein Bait-Protein (eine bekannte oder vermutete Komplexkomponente) ist sowohl mit Protein A als auch mit einem Calmodulin-bindenden Peptid (CBP) markiert, wobei sich zwischen den beiden Markierungen eine Tabakätzvirus (TEV)-Proteasespaltstelle befindet. Das doppelt markierte Bait-Protein wird in nahezu natürlichen Mengen exprimiert, da eine Überexpression unphysiologische Wechselwirkungen auslösen kann. Der Komplex wird zunächst über das Protein-A-Tag an IgG-Sepharose-Beads adsorbiert und durch Spaltung mit TEV eluiert. Der Komplex wird dann (über das CBP-Tag) an Calmodulin-Sepharose-Beads adsorbiert und mit EGTA eluiert. Die komplexen Komponenten werden durch SDS-PAGE getrennt und mittels Massenspektrometrie analysiert.

Abbildung 2.5. Überblick über die Tandem Affinity Purification (TAP)-Methode. Das TAP-Tag besteht aus CBP (Calmodulin-bindendes Peptid), das mit einer Protein-A-Domäne verbunden ist, welche durch eine TEV-Spaltstelle getrennt ist. Die Erlaubnis zum Nachdruck dieser Abbildung wurde vom Elsevier Global Rights Department erteilt.

In höheren Organismen kann es notwendig sein, das entsprechende endogene Gen für das Zielprotein durch den Einsatz der RNAi-Technologie (iTAP) zu unterdrücken.

Co-Immunpräzipitation

Die Immunpräzipitation ist ein bewährtes Verfahren, in dem Antikörper zur Isolierung von Antigenen aus biologischen Rohproben eingesetzt werden. Der Name ist historisch bedingt und geht auf Analyseverfahren zurück, die auf der Fällungsreaktion beruhen, welche sich ergibt, wenn Antikörper und Antigen im richtigen Verhältnis gemischt werden. Beim hier beschriebenen Verfahren handelt es sich eher um einen Pulldown-Assay, nicht um eine Fällungsreaktion. Bei der Co-Immunpräzipitation werden Antikörper verwendet, die gegen eine (bekannte oder vermutete) Komponente eines Komplexes gerichtet sind. Der Antikörper bindet an sein Antigen, das Teil eines Multiproteinkomplexes ist. Der Antikörper-Protein-Komplex wird dann durch Zugabe von Protein-A- oder Protein-G-Sepharose-Beads zum Gemisch eingefangen. Das Prinzip ist in Abbildung 2.6 dargestellt.

Alternativ kann ein geeigneter Antikörper auf einer aktivierten Matrix, wie z. B. einer NHS-aktivierten Sepharose, immobilisiert werden. In ähnlicher Weise kann ein Antikörper mit einem Protein-A- oder Protein-G-Medium quervernetzt und für die Co-Immunpräzipitation von Proteinkomplexkomponenten verwendet werden.

Abbildung 2.6. Skizzierung eines Co-Immunpräzipitationsversuchs.

Co-Immunpräzipitation mit Protein A oder Protein G

Materialien Starter Pack für die Immunpräzipitation (enthält nProtein A Sepharose 4 Fast Flow und Protein G Sepharose 4 Fast Flow)

Lysepuffer

Tabelle 2.3 Gängige Lysepuffer für Säugergewebekulturzellen

Name	Beschreibung	Stringenz
Niedriger Salzgehalt	1 % Igepal™ CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8,0	+
Nonidet™ P-40	150 mM NaCl, 1 % Igepal CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8,0	++
RIPA	150 mM NaCl, 1 % Igepal CA-630, 0,5 % Natriumdesoxycholat (DOC), 0,1 % SDS, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8,0	+++
Hoher Salzgehalt	500 mM NaCl, 1 % Igepal CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8,	++++

Weitere Puffer

PBS: 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4

Waschpuffer: 50 mM Tris, pH 8

Probenpuffer: 1 % SDS, 100 mM DTT, 50 mM Tris, pH 7,5 (reduzierend)
 

Medienherstellung

nProtein A Sepharose 4 Fast Flow und Protein G Sepharose 4 Fast Flow werden in 20 % Ethanol vorgequollen geliefert. Jedes Medium muss vor der Verwendung gründlich gewaschen werden, um die 20 % Ethanol-Aufbewahrungslösung zu entfernen. Die nachfolgenden Verfahren können durch Ethanolreste beeinträchtigt werden.

Es werden 50 µl nProtein A Sepharose 4 Fast Flow oder Protein G Sepharose 4 Fast Flow 50 % Suspension pro Probe benötigt. Sicherstellen, dass die Beads vor dem Transfer ordnungsgemäß suspendiert sind.

1. Die Flasche mit nProtein A Sepharose 4 Fast Flow oder Protein G Sepharose 4 Fast Flow vorsichtig schütteln, um das Medium zu resuspendieren.
2. Eine Pipette mit einer breiten Spitze einsetzen, um eine ausreichende Menge Aufschlämmung zu entnehmen, und die Aufschlämmung in ein geeignetes Gefäß/Röhrchen umfüllen. Bei Bedarf die Pipettenspitze abschneiden, um eine größere Öffnung zu erhalten.
3. Das Medium durch Zentrifugieren bei 12.000 × g für 20 s sedimentieren. Den Überstand vorsichtig dekantieren.
4. Das Medium durch Zugabe von 10 Volumina Lysepuffer (siehe unten) waschen. Zum Mischen umdrehen.
5. Das Medium durch Zentrifugieren bei 12.000 × g für 20 s sedimentieren. Den Überstand dekantieren.
6. Die Schritte 4 und 5 in insgesamt drei Waschgängen wiederholen.

Für jeden entnommenen ml der ursprünglichen Aufschlämmung des Mediums aus Schritt 2 0,5 ml Lysepuffer hinzufügen. Dies ergibt eine Aufschlämmung von 50 %. Bei 4 ºC aufbewahren und vor Gebrauch gut mischen.

Binden des Antigens

1. Die Proben (500 µl) in neue Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren.
2. Polyklonales Serum (0,5 bis 5 µl), Hybridom-Gewebekulturüberstand (5 bis 100 µl), Aszitesflüssigkeit (0,1 bis 1 µl) oder aufgereinigte monoklonale oder polyklonale Antikörper (ein Volumen, das 1 bis 5 µg entspricht) hinzufügen. Für die Kontrollen nicht-immune Antikörper verwenden, die dem spezifischen Antikörper möglichst ähnlich sind (z. B. soll polyklonales Serum mit normalem Serum derselben Spezies verglichen werden).
3. Vorsichtig 1 h bei 4 °C mischen.

Ausfällung des Immunkomplexes

1. 50 µl nProtein A Sepharose 4 Fast Flow oder Protein G Sepharose 4 Fast Flow Suspension (50 % Aufschlämmung) hinzufügen.
2. Vorsichtig 1 h bei 4 °C mischen.
3. 20 s bei 12.000 × g zentrifugieren und das Pellet (die Beads) aufbewahren.
4. Das Pellet dreimal mit 1 ml Lysepuffer und einmal mit Waschpuffer waschen. Zwischen den einzelnen Waschvorgängen 20 s bei 12.000 × g zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen.

Dissoziation und Analyse

1. Das finale Pellet in 30 µl Probenpuffer suspendieren.
2. Auf 95 ºC erwärmen und 3 min inkubieren.
3. 20 s bei 12.000 × g zentrifugieren, um die Beads zu entfernen. Den Überstand vorsichtig in ein sauberes Röhrchen überführen.
4. 1 µl Bromophenolblau (0,1 %) zum Überstand zugeben.
5. Den Überstand mittels SDS-PAGE analysieren, gefolgt von Proteinfärbung, Trypsinverdau und Analyse durch Massenspektrometrie.