XBAI-RO

Xba I

from recombinant E.Coli

• UNSPSC Code: 12352204
• NACRES: NA.54
• Biological source: Escherichia coli

Eigenschaften

• biological source: Escherichia coli
• form: solution
• packaging: pkg of 1,000 U (10674257001 [10 U/μl]), pkg of 20,000 U (10674273001 [10 U/μl]), pkg of 20,000 U (11047663001 [40 U/μl]), pkg of 5,000 U (10674265001 [10 U/μl])
• manufacturer/tradename: Roche
• parameter: 37 °C optimum reaction temp.
• technique(s): DNA sequencing: suitable
• storage temp.: −20°C

Beschreibung

General description

Xba I erkennt die Sequenz T↓*CTAGA und erzeugt Fragmente mit 5′-kohäsiven Termini. Das Enzym benötigt mindestens zwei Nukleotide um die Zielsequenz, bevor es die Spaltstelle schneidet.

Kompatible Enden
Xba-I-Enden sind kompatibel mit Fragmenten, die von Avr I, Nhe I und Spe I erzeugt werden.

Isoschizomere
Es ist nicht bekannt, dass das Enzym Isoschizomere hat.

Methylierungsempfindlichkeit
Der Xba-I-Verdau der DNA wird durch das Dam-Genprodukt von E. coli gehemmt, das die 6N-Position von Adenin in der Sequenz GATC methyliert. Das Enzym wird auch durch 5-Methylcytosin oder 5-Hydroxymethylcytosin an der auf der Erkennungssequenz angegebenen Stelle (*) inhibiert.

Aktivität im SuRE/Cut-Puffersystem
Für eine optimale Aktivität wird durch Fettdruck gekennzeichnete Puffer empfohlen:
A B L M H
100 % 75–100 % 75–100 % 75–100 % 100 %

Relative Aktivität im kompletten PCR-Mix
Die relative Aktivität im PCR-Mix (Taq-DNA-Polymerase-Puffer) beträgt 60 %. Der PCR-Mix enthielt λDNA, Primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3, +20 °C), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 2,5 U Taq-DNA-Polymerase. Der Mix wurde 25 Amplifikationszyklen unterzogen. Die Aktivität im Reaktionspuffer des Pwo-SuperYield-DNA-Polymerase-PCR-Mixes beträgt 25 %. Bei Zugabe von GC-RICH-Lösung steigt die Aktivität auf 100 %.

Inkubationstemperatur
+37 °C


Anzahl der Spaltstellen auf verschiedenen DNAs
λ Ad2 SV40 φX174 M13mp7 M13mp18 pBR322 pBR328 pUC18
1 5 0 0 0 1 0 0 1

Mit PFGE getestet
Xba I wurde mithilfe der Pulsed-Field-Gelelektrophorese (an bakteriellen Chromosomen) getestet. Für die Spaltung von in Agarose eingebetteter genomischer DNA (E. coli C 600) für die PFGE-Analyse empfehlen wir 10 U Enzym pro μg DNA und ca. 4 Stunden Inkubationszeit.

Ligations- und Nachschneideassay
Xba-I-Fragmente, die durch vollständigen Verdau von 1 μg pUC18-DNA gewonnen wurden, werden mit 1 U T4-DNA-Ligase in einem Volumen von 10 μL durch Inkubation für 16 Stunden bei +4 °C in 66 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP bei einem pH von 7,5 (bei +20 °C) ligiert, was zu einer Rückgewinnung von >90% der pUC18-DNA führt.
Nachfolgendes Nachschneiden mit Xba I ergibt >95 % des typischen Musters von pUC18 × Xba-I-Fragmenten.

Application

Das Restriktionsenzym Xba I wird für den Verdau genomischer DNA verwendet.[1]

Biochem/physiol Actions

Star-Aktivität
Die Sequenzspezifität von Xba I wird bei niedriger Ionenstärke oder durch Zugabe von Glycerin, Ethanol oder DMSO zum Inkubationsgemisch gelockert.
Erkennungsstellen: TCTAGA
TCTAGA
Erkennungsstelle: T↓CTAGA
T↓CTAGA
Hitze-Inaktivierung: Xba I kann durch 15-minütige Inkubation bei 65 °C hitzeinaktiviert werden (bis 15 U/μg DNA). Höhere Konzentrationen von Xba I können unter diesen Bedingungen nicht vollständig hitzeinaktiviert werden.

Anzahl der Spaltstellen auf verschiedenen DNAs

• λ: 1
• φX174: 0
• Ad2: 5
• M13mp7: 0
• pBR322: 0
• pBR328: 0
• pUC18: 1
• SV40: 0

Analysis Note

Abwesenheit von unspezifischen Endonuklease-Aktivitäten
1 μg λDNA wird 16 Stunden in 50 μL SuRE/Cut-Puffer H mit einem Überschuss an Xba I inkubiert. Die Anzahl der Enzymeinheiten, die das enzymspezifische Muster nicht verändern, ist im Analysenzertifikat angegeben.

Abwesenheit von Exonuklease-Aktivität
Etwa 5 μg [3H]-markierte Kalbsthymus-DNA werden mit 3 μL Xba I 4 Stunden bei +37 °C in einem Gesamtvolumen von 100 μL 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 und 1 mM Dithioerythritol bei einem pH von ca. 7,5 inkubiert. Unter diesen Bedingungen ist keine Freisetzung von Radioaktivität nachweisbar, wie im Analysenzertifikat angegeben.

SuRE/Cut-Puffersystem
Für eine optimale Aktivität wird der durch Fettdruck gekennzeichnete Puffer empfohlen

• A: 100 %
• B: 75–100 %
• H: 100 %
• L: 75–100 %
• M: 75–100 %

Aktivität im PCR-Puffer: 60 %

Die relative Aktivität im PCR-Mix (Taq-DNA-Polymerase-Puffer) beträgt 60 %. Der PCR-Mix enthielt λDNA, Primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3, 20 °C), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 200 μM dNTPs, 2,5 U Taq-DNA-Polymerase. Der Mix wurde 25 Amplifikationszyklen unterzogen. Die Aktivität im Reaktionspuffer des Pwo-SuperYield-DNA-Polymerase-PCR-Mixes beträgt 25 %. Bei Zugabe von GC-RICH-Lösung steigt die Aktivität auf 100 %. Der Pwo-SuperYield-DNA-Polymerase-PCR-Mix ist in den USA nicht erhältlich.

Other Notes

Eine Einheit ist die Enzymaktivität, die 1 μg λdam^–-DNA in einer Stunde bei +37 °C in einem Gesamtvolumen von 50 μL (1x) SuRE/Cut-Puffer H vollständig spaltet.

Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht für den Einsatz in diagnostischen Verfahren geeignet.

Nur Kit-Komponenten

• Enzyme Solution
• SuRE/Cut Buffer H 10x concentrated

Sicherheitshinweise

• Lagerklasse: 12 - Non Combustible Liquids
• wgk: WGK 1
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