MABS1330

Anti-N1-Phosphohistidin-(1-pHis-)Antikörper, Klon SC1-1

clone SC1-1, from rabbit

• Synonym(e): N1-Phosphohistidine
• UNSPSC Code: 12352203
• NACRES: NA.41
• eCl@ss: 32160702
• Clone: SC1-1, monoclonal
• Species reactivity: E. coli, human
• Application: DB, ICC, WB, affinity chromatography
• Citations: 7

Eigenschaften

• biological source: rabbit
• Quality Segment: 100
• antibody form: purified antibody
• antibody product type: primary antibodies
• clone: SC1-1, monoclonal
• species reactivity: E. coli, human
• species reactivity (predicted by homology): all
• technique(s): affinity chromatography: suitable, dot blot: suitable, immunocytochemistry: suitable, western blot: suitable
• isotype: IgG
• shipped in: wet ice
• target post-translational modification: phosphorylation (N1-pHis)

Beschreibung

General description

Die Phosphorylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung von Proteinaktivitäten und verschiedenen zellulären Signalübertragungsereignissen in Zellen. Die meisten Studien konzentrieren sich auf Serin-, Threonin- und Tyrosinphosphorylierungen und sind durch die verfügbaren Instrumente zum Nachweis von Phosphohistidin (pHis) begrenzt. Die Phosphorylierung von Histidin kann entweder an N1 (1-pHis) oder N3 (3-pHis) des Imidazolrings erfolgen. Die Entwicklung von Peptiden, die stabile Phosphoryltriazolylalanin-Analoga von 1-pHis und 3-pHis (1-pTza und 3-pTza) enthalten, ermöglicht die Herstellung von Antikörpern zur Untersuchung von Histidin-N1- und N3-Phosphorylierungen bei Signalübertragungsereignissen. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass His-Kinasen bei Krebs und Tumormetastasen eine Rolle spielen, und das erste identifizierte Metastasensuppressor-Gen ist eine der beiden bekannten His-Kinasen, Nm23-H1, bei Säugetieren (auch bekannt als NME1, Nukleosiddiphosphatkinase oder NDPK-A). Nm23-H1/NME1 und das eng verwandte Nm23-H2 (NME2/NDPK-B) katalysieren den Transfer von Phosphat aus ATP auf Nukleosiddiphosphate (NDPs) über ein 1-pHis-Enzymintermediat. Nm23-H1/-H2 weisen auch eine His-Kinase-Aktivität auf, bei der das Phosphat aus dem aktiven Zentrum pHis auf ein His in einem Zielprotein übertragen wird. Stoffwechselenzyme wie die Phosphoglyceratmutase (PGAM), die Succinyl-CoA-Synthase (SCS) und die ATP-Citrat-Lyase (ACL) verwenden ebenfalls pHis als Enzymintermediat. Im Gegensatz zu NME1/2 verwendet PGAM 3-pHis als Enzymintermediat. Außer bei Eukaryoten ist die Histidinphosphorylierung auch in bakteriellen “Zweikomponenten”-Signalwegen gut dokumentiert, die an der Chemotaxis beteiligt sind, obwohl das Phosphat von dem im Rezeptor/Sensorprotein gebildeten pHis auf Asp-Reste eines Akzeptor-Reaktionsregulatorproteins übertragen wird und das Rezeptor/Sensorprotein im Wesentlichen als Aspartatkinase fungiert.

Je nach Größe der Histidinphosphorylierungs-Proteine variabel.

Immunogen

Epitop: N1-Phosphohistidin (1-pHis)

KLH-konjugierte Bibliothek von zufällig gewählten Peptiden mit nicht hydrolysierbarem Phosphohistidin-Analogon 1-pTza.

Application

Anti-N1-Phosphohistidin-(1-pHis-)Antikörper, Klon SC1-1, ist ein isomerspezifischer, monoklonaler Ab, der speziell zum Nachweis von phosphoryliertem Histidin an Position N1 dient. Dieser aufgereinigte mAb wird durch veröffentlichte Daten gestützt, die die Leistungsfähigkeit bei Western Blotting, Immunfluoreszenz und Immunaffinitätsaufreinigung belegen.

Dot-Blot-Analyse: Mit einer repräsentativen Charge wurden die In-vitro-Autophosphorylierung von rekombinantem humanem NM23-H1/NME1 an His118 sowie Peptide mit 1-pTza-, aber nicht 3-pTza-Phosphohistidin-Analogon nachgewiesen. Klon SC1-1 ist am reaktivsten gegenüber 1-pTza-Peptiden auf Basis der NM23-H1/NME1-1-pHis118-Sequenz, weniger reaktiv gegenüber 1-pTza-Peptiden auf Basis der Histon-H4-1-pHis18- oder ACLY-1-pHis760-Sequenz, am wenigsten reaktiv gegenüber 1-pTza-Peptiden auf Basis der GNB1-1-pHis266- oder Kca3.1-1-pHis358-Sequenz und nicht reaktiv gegenüber phosphoryliertem Tyrosin (Fuhs, S.R., et al. (2015). Cell. 162(1):198-210).
Western-Blot-Analyse: Mit einer repräsentativen Charge wurde die hitzeempfindliche Histidin-N1-Phosphorylierung (1-pHis) in mehreren Zelllysaten nachgewiesen (Fuhs, S.R., et al. (2015). Cell. 162(1):198-210).
Immunozytochemische Analyse: Mit einer repräsentativen Charge wurde die Immunreaktivität von N1-Phosphohistidin (1-pHis), die sich von der von 3-pHis unterscheidet, in mit 4 % Paraformaldehyd fixierten HeLa-Zellen und in Makrophagen aus dem Knochenmark der Maus mittels Fluoreszenz-Immunzytochemie nachgewiesen. Die Immunreaktivität von 1-pHis wurde in Regionen in der Umgebung saurer Kompartimente festgestellt, jedoch nicht innerhalb dieser Kompartimente oder in Zellkernen (Fuhs, S.R., et al. (2015). Cell. 162(1):198-210).
Immunaffinitätsaufreinigung: Eine repräsentative Charge wurde vor der LC-MS/MS-Analyse mit Protein-A-Harzen für die Immunaffinitätsaufreinigung von 1-pHis-Proteinen aus Zelllysaten vernetzt (Fuhs, S.R., et al. (2015). Cell. 162(1):198-210).
Hinweis: PROBEN vor dem Phosphohistidin-Nachweis NICHT ERHITZEN. Die Histidinphosphorylierung ist hitze- und säureempfindlich. Um eine Negativkontrolle für den Spezifitätstest zu erstellen, kann ein Aliquot der Probe 10–15 Minuten lang auf 95 ºC erhitzt werden, um die Histidinphosphorylierung rückgängig zu machen. Alternativ kann ein Aliquot der Probe unter angesäuertem pH-Wert bei 37 ºC 15 Minuten lang inkubiert werden, um die Histidinphosphorylierung zu reduzieren. Jede 100-µ-l-Probe wird vor der Inkubation mit 25 µl 1 M HCl angesäuert und dann vor dem Phosphohistidin-Nachweis mit 25 µl 1 M NaOH neutralisiert.

Biochem/physiol Actions

Die Zielmodifizierung ist nicht speziesspezifisch.

Weist selektiv Proteine nach, deren Histidin(e) an N1 des Imidazolrings (1-pHis) phosphoryliert ist/sind, aber nicht an 3-pHis.

Physical form

Format: Aufgereinigt

Analysis Note

Beurteilt mittels Western Blotting der Autophosphorylierungsreaktion von NME1.

Western-Blot-Analyse: Mit 0,3 µg/ml dieses Antikörpers wurde rekombinantes humanes NME1 (NM23-H1) mit N1-Phosphohistidin (1-pHis) in einem 5-µg-Aliquot einer Autophosphorylierungsreaktion nachgewiesen.

Other Notes

Konzentration: Die Konzentration entnehmen Sie bitte dem chargenspezifischen Datenblatt.

Sicherheitshinweise

• Lagerklasse: 12 - Non Combustible Liquids
• Was ist los?: WGK 1