Análisis de pirógenos
El análisis de pirógenos determina la presencia o ausencia de pirógenos en productos farmacéuticos de administración por vía parenteral y es regulado por diversas normas de organizaciones como la Administración estadounidense de Fármacos y Alimentos (FDA), la Farmacopea de Estados Unidos (USP) o la Farmacopea europea (EP). La esterilidad de un producto no implica que carezca de pirógenos. Por consiguiente, los medicamentos que dicen ser estériles también deben ser sometidos a ensayos de pirógenos para evitar reacciones febriles en los pacientes.
La contaminación por pirógenos puede tener lugar durante la producción o la administración de productos farmacéuticos, productos bioterapéuticos y productos médicos, pero la presencia de pirógenos puede también ser una característica inherente al producto, como los adyuvantes en las vacunas o los lipopéptidos sintéticos.
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¿Qué es un pirógeno?
Un pirógeno es una sustancia que provoca un aumento de la temperatura (fiebre) en un ser humano o un animal a través de la activación del sistema inmunitario innato. Los pirógenos constituyen un grupo heterogéneo de contaminantes que abarcan sustancias microbianas y no microbianas. Los pirógenos se clasifican en dos grupos: endotoxinas y no endotoxinas (NEP). Las endotoxinas son sustancias encontradas en las bacterias gramnegativas. Los pirógenos no provenientes de endotoxinas son otras sustancias microbiológicas, como las procedentes de las bacterias grampositivas o de los virus y los pirógenos provenientes de levaduras y hongos. Las sustancias pirógenas no microbianas también pueden proceder de partículas de goma, partículas de plástico microscópicas o compuestos de metal de los elastómeros.
Existen diversos métodos de análisis para la detección de pirógenos. Pueden clasificarse en función del tipo de contaminante que detectan y si requieren o no materiales de origen animal para realizar la prueba, como se describe en la tabla siguiente:
Prueba de pirógenos en conejos
La prueba de pirógenos en conejos (RPT) consiste en medir la elevación de la temperatura de los conejos después de la inyección intravenosa del producto a ser analizado. La RPT proporciona resultados cualitativos y la sensibilidad es muy baja. La robustez de la prueba es también limitada debido al desarrollo de tolerancia a los pirógenos en los conejos después de inyecciones repetidas o al estrés producido en estos animales cuando se realiza la prueba.
Prueba de activación de monocitos
La prueba de activación de monocitos (MAT) es una alternativa a los métodos en los que se utilizan animales para la detección de pirógenos provenientes de endotoxinas y no endotoxinas. La prueba de activación de monocitos imita la reacción inmunitaria humana mediante la incubación de monocitos con la muestra problema. Si hay pirógenos, los monocitos se activan y producen las moléculas inflamatorias citocinas responsables de la reacción febril. A continuación, las citocinas se detectan utilizando un inmunoanálisis (ELISA) en el que se utilizan anticuerpos específicos y una reacción de color enzimática.
Nota: La Farmacopea Europea (Ph. Eur.) tomó la decisión de emprender un camino que en última instancia debería conducir a la sustitución completa de la prueba de pirógenos en conejos (RPT) en la Ph. Eur., en un plazo aproximado de 5 años.
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Prueba de endotoxinas bacterianas (prueba LAL)
El método más común para el análisis de endotoxinas es la prueba del lisado de amebocitos de Limulus (prueba LAL); un análisis basado en el lisado de amebocitos de la sangre del cangrejo de herradura. El lisado de las células sanguíneas del cangrejo de herradura reacciona de forma natural con las endotoxinas bacterianas en una reacción de coagulación. Este método tiene una gran sensibilidad para la cuantificación de endotoxinas, pero no detecta pirógenos que no sean endotoxinas.
Análisis del factor C recombinante (rFC)
El factor C recombinante es una proteína producida mediante ingeniería genética encontrada normalmente en la cascada del lisado de amebocitos de Limulus. En esta prueba, el factor C reacciona con la endotoxina y se acopla a un marcador para producir un producto final fluorescente cuantificable. En la prueba del factor C recombinante se utiliza el mismo principio que en la prueba LAL, pero sin necesidad de material de procedencia animal.
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