Cribado genómico funcional
La genómica funcional permite el descubrimiento de la función de los genes y su intervención en las vías bioquímicas, celulares y fisiológicas. La disponibilidad de secuencias genómicas completas, combinadas con herramientas fácilmente programables para modificar el genoma, permite la realización de esos análisis a escala de todo el genoma. El objetivo básico de un cribado genómico es entender la aparición de un fenotipo específico mediante la modificación de la función génica de una manera intencionada y dirigida. Cuando se eliminan o modulan genes individuales en una célula u organismo, pueden observarse los cambios en el fenotipo o en el comportamiento directa o indirectamente a través de experimentos cuidadosamente planificados. El cribado genómico funcional permite la realización de este análisis de una manera sistemática y en paralelo, esclareciendo vías intricadas y enfermedades, y facilitando la identificación de nuevos medicamentos específicos.
Hay dos maneras fundamentales mediante las cuales la genómica funcional puede vincular la genética con el fenotipo. El cribado genético directo implica la modificación de muchos genes, seleccionando las células u organismos con el fenotipo de interés y luego identificando los genes cuya modulación desencadenó el cambio fenotípico. El cribado genético inverso analiza el fenotipo de las células o los organismos después de la alteración de un gen específico o una combinación de genes.
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Los avances en modificación génica, silenciamiento génico, modulación génica, secuenciación de nueva generación (NGS) y tecnologías de cribado fenotípico permiten la ejecución eficiente de cribados genómicos funcionales en una amplia variedad de sistemas modelo.
- ARN de interferencia (RNAi) Pueden emplearse varios tipos de ARN de interferencia (RNAi) para el silenciamiento génico: ARN largo bicatenario (dsRNA), ANR de interferencia pequeño sintético (siRNA) y horquillas pequeñas de ARN (shRNA). Estas herramientas RNAi se introducen en las células mediante transfección directa del factor modulador (los siRNA y los dsRNA), mediante transfección del ADN que codifica el shRNA impulsado por promotor o mediante métodos de transducción vírica utilizando constructos de lentivirus con casetes de shRNA clonadas. El dsRNA y el siRNA pueden utilizarse en bibliotecas en matriz para el cribado de alto rendimiento, mientras que los shRNA pueden introducirse en las poblaciones celulares en bibliotecas en matriz o en bibliotecas agrupadas para análisis de gran rendimiento; el formato agrupado utiliza la secuenciación de nueva generación (NGS) para deconvolución.
- Sistemas CRISPR-Cas: Los sistemas CRISPR ((nucleasas de secuencias palindrómicas repetidas inversas) pueden utilizarse para manipular los genomas, transcriptomas y epigenomas de las células de mamíferos. En la edición génica con CRISPR-Cas9, se dirige una nucleasa Cas9 a un locus específico utilizando un ARN guía. Dependiendo de la variante Cas9 empleada, el CRISPR puede utilizarse para la producción genéticamente silenciosa de transcritos mediante la introducción de mutaciones de desfase del marco de lectura, la represión de la maquinaria de transcripción, el reclutamiento de factores de transcripción para activar la expresión, la inducción de mutaciones puntuales dirigidas o la modificación de marcadores epigenéticos. Igual que el RNAi, el CRISPR puede introducirse directamente como un complejo RNP en bibliotecas en matriz o como ADN plasmídico o en lentivirus para aplicaciones en formato agregado y en matriz. Las combinaciones, bancos y matrices de CRISPR facilitan un cribado de gran rendimiento, excepcionalmente versátil, de genes para análisis funcional. También es posible el cribado de la modulación del genoma con un sistema CRISPR exento de nucleasa que utiliza la dCas9 enzimáticamente inactiva con efectores transcripcionales que o bien activan (CRISPRa) o bien inhiben (CRISPRi) la transcripción génica, produciendo un aumento o una disminución de la expresión génica.
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