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  • Defining a conformational consensus motif in cotransin-sensitive signal sequences: a proteomic and site-directed mutagenesis study.

Defining a conformational consensus motif in cotransin-sensitive signal sequences: a proteomic and site-directed mutagenesis study.

PloS one (2015-03-26)
Wolfgang Klein, Carolin Westendorf, Antje Schmidt, Mercè Conill-Cortés, Claudia Rutz, Marcus Blohs, Michael Beyermann, Jonas Protze, Gerd Krause, Eberhard Krause, Ralf Schülein
RESUMEN

The cyclodepsipeptide cotransin was described to inhibit the biosynthesis of a small subset of proteins by a signal sequence-discriminatory mechanism at the Sec61 protein-conducting channel. However, it was not clear how selective cotransin is, i.e. how many proteins are sensitive. Moreover, a consensus motif in signal sequences mediating cotransin sensitivity has yet not been described. To address these questions, we performed a proteomic study using cotransin-treated human hepatocellular carcinoma cells and the stable isotope labelling by amino acids in cell culture technique in combination with quantitative mass spectrometry. We used a saturating concentration of cotransin (30 micromolar) to identify also less-sensitive proteins and to discriminate the latter from completely resistant proteins. We found that the biosynthesis of almost all secreted proteins was cotransin-sensitive under these conditions. In contrast, biosynthesis of the majority of the integral membrane proteins was cotransin-resistant. Cotransin sensitivity of signal sequences was neither related to their length nor to their hydrophobicity. Instead, in the case of signal anchor sequences, we identified for the first time a conformational consensus motif mediating cotransin sensitivity.

MATERIALES
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Sigma-Aldrich
Dimetilsulfóxido, Hybri-Max, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7%
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Sigma-Aldrich
Dimetilsulfóxido, ACS reagent, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Ácido trifluoroacético, suitable for HPLC, ≥99.0%
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Ácido trifluoroacético, ReagentPlus®, 99%
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Sigma-Aldrich
Dimetilsulfóxido, for molecular biology
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Dimetilsulfóxido, suitable for HPLC, ≥99.7%
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Dimetilsulfóxido, sterile-filtered, BioPerformance Certified, meets EP, USP testing specifications, suitable for hybridoma
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Sigma-Aldrich
Dimetilsulfóxido, ReagentPlus®, ≥99.5%
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Ácido trifluoroacético, puriss. p.a., suitable for HPLC, ≥99.0% (GC)
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Sigma-Aldrich
Dimetilsulfóxido, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
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Sigma-Aldrich
Azul de tripano solution, 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
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Sigma-Aldrich
Dimetilsulfóxido, puriss. p.a., ACS reagent, ≥99.9% (GC)
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Sigma-Aldrich
Ácido trifluoroacético, ≥99%, for protein sequencing
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Sigma-Aldrich
Dimetilsulfóxido, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC)
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Trypan Blue, powder, BioReagent, suitable for cell culture
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Dimetilsulfóxido, PCR Reagent
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Dimetilsulfóxido, puriss. p.a., dried, ≤0.02% water
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Sigma-Aldrich
Dimetilsulfóxido, anhydrous, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Trypan Blue, Dye content 60 %, ≥80% (HPLC)
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USP
Dimetilsulfóxido, United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard
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Sigma-Aldrich
Azul de tripano solution, 0.4%, for microscopy
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Sigma-Aldrich
Anti-α-Tubulin Mouse mAb (DM1A), liquid, clone DM1A, Calbiochem®
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Sigma-Aldrich
Ácido trifluoroacético, SAJ special grade, ≥99.0%
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Sigma-Aldrich
Dimetilsulfóxido, meets EP testing specifications, meets USP testing specifications
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Sigma-Aldrich
Dimetilsulfóxido, ≥99.5%
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Supelco
Ácido trifluoroacético, analytical standard
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Sigma-Aldrich
Dimetilsulfóxido, JIS special grade, ≥99.0%
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Sigma-Aldrich
β-D-Allose, rare aldohexose sugar
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Sigma-Aldrich
Dimethyl sulfoxide solution, 50 wt. % in H2O
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Supelco
Dimetilsulfóxido, analytical standard
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