Resolución de problemas de contaminación en los cultivos celulares

Descripción general
Tipos de contaminación
Causas comunes y prevención de los contaminantes
   Microbianos (bacterias, hongos y levaduras)
   Micoplasmas
   Contaminación vírica
   Contaminación química
Consejos y técnicas generales
   Trabajar dentro de una cabina de seguridad biológica
   Pipeteo y prevención de aerosoles
   Desinfección
   Cómo realizar el control sistemático de las células sanas

Contaminación de cultivos: Descripción general:

La "contaminación de los cultivos celulares" suele evocar pensamientos de bacterias entre las células y medios turbios, pero los invasores no deseados en los matraces de cultivo pueden adoptar muchas formas. Los contaminantes víricos y químicos también pueden tener consecuencias considerables para la salud de los cultivos, y garantizar que las líneas celulares no experimenten contaminación cruzada es fundamental para la reproducibilidad de los resultados.

¿Hasta qué punto está generalizada la contaminación celular? Según los estudios de la FDA, la ATCC y otros, se estima que entre el 5 y el 30% de todos los cultivos celulares actuales están contaminados solo por especies de micoplasma. La incidencia de la contaminación vírica de líneas celulares comunes superó el 25 % en un estudio⁵, y es incluso más probable que escapen a la detección los virus no citopáticos que los micoplasmas, ya que la salud del cultivo puede no proporcionar pistas de su presencia.

Figura 1. Contaminación celular

La clave para controlar un contaminante específico está relacionada a veces con la facilidad con la que se detecta. Los contaminantes bacterianos, fúngicos y levaduras son a menudo visibles a simple vista y pueden matar rápidamente las células del cultivo, pero una morfología sutil puede hacer que intrusos microbianos significativos como el micoplasma sean más difíciles de identificar. En comparación, los virus no pueden detectarse en absoluto con el microscopio óptico convencional, y por consiguiente, su descubrimiento es a menudo provocado por observaciones de desprendimiento inexplicable u otros signos de mala salud celular o incluso muerte celular.

Una de las preocupaciones más significativas a las que se enfrenta la comunidad biológica en los últimos años es la contaminación o incluso la identificación errónea de líneas celulares de investigación. Si desea más información sobre este importante tema, pulse aquí para comprender las causas y la prevalencia de líneas celulares con contaminación cruzada, y cómo evaluar la integridad de la identidad de las líneas celulares.

Tipos de contaminación de los cultivos

Bacterias, hongos, levaduras:
contaminantes microbianos

La contaminación bacteriana, fúngica (incluidos los mohos) y por levaduras suelen ser visibles a simple vista como turbidez de inicio rápido y cambio de color del medio de cultivo (siempre que el medio esté enriquecido con rojo fenol, el indicador de pH no tóxico más común). El microscopio óptico convencional revelará también células bacterianas y estructuras fúngicas, por lo que la observación microscópica diaria de los cultivos garantizará la detección temprana de la contaminación microbiana y permitirá tomar las medidas apropiadas en cuanto se manifiesten los primeros signos. En particular, deben eliminarse enseguida los cultivos contaminados para proteger los cultivos vecinos, así como el entorno estéril de cultivo de tejidos, como incubadoras de cultivos, baños y cabina de bioseguridad. Además, deben utilizarse pruebas específicasde bacterias y hongos como parte de un procedimiento de cribado de control de calidad regular y sistemático.

Causas comunes y prevención de la contaminación microbiana

Raíz / causa	Prevención
Técnica:
Manipulaciones, pipeteo, dispensación
Superficies y equipos no estériles	Despeje el área de trabajo de los elementos no necesarios para uso inmediato.
Derrames en el cuello y el exterior de las botellas y en la superficie de trabajo.	Limpie regularmente con alcohol al 70 %. No vierta líquidos. Dispense con pipeta, autodispensador o dispositivo de transferencia. Si el vertido es inevitable: (1) hágalo con un movimiento suave, (2) deseche la botella desde la que se ha vertido.
Tocar o sujetar la pipeta demasiado cerca de la punta, tocar cuellos de botellas, en el interior de los tapones de rosca	Sostenga las pipetas por encima de las graduaciones. Manipule las pipetas estériles con la funda protectora.
Salpicaduras del vaso de residuos	Deseche los residuos del vaso de precipitados con un embudo o utilice el vacío para extraer los residuos siempre que sea posible.
Sedimentación de polvo o partículas de piel que se depositan en el cultivo o la botella; manos o aparatos sostenidos sobre una placa abierta, botella, plato	Nunca pase las manos, trabaje sobre recipientes abiertos No trabaje sobre (flujo laminar vertical y mesa de trabajo abierto) o por detrás y sobre (campana de flujo laminar horizontal) una botella o placa de cultivo abiertas.
Cabello, manos, respiración, ropa del analista
Polvo de la piel, el cabello o la ropa que se cae o es arrastrado al cultivo	Lávese bien las manos, use una bata de laboratorio que no libere pelusas. Utilice una bata de laboratorio reservada en exclusiva para sala de cultivos. Recójase el cabello largo o póngase un gorro. Póngase mirando contra la zona de trabajo cuando tenga que hablar.
Aerosoles emitidos al hablar, toser, estornudar, etc.	Evite trabajar si tiene un resfriado, o use una mascarilla.
Materiales y reactivos
Disoluciones
Reactivos y medios no estériles	Filtre o esterilice en autoclave antes de su uso.
Procedimientos de esterilización inadecuados	Controle el rendimiento del autoclave con un termómetro registrador o un indicador de esterilidad. Analice o cultive las disoluciones esterilizadas si sospecha contaminación.
Control de calidad deficiente en el proveedor comercial.	Obtengamedios, disoluciones tampón y sueros solo de proveedores acreditados que certifiquen calidad y procedencia.
Material de vidrio y tapones de rosca
Polvo y esporas del almacenamiento	Envuelva los tapones con papel de aluminio. Limpie las botellas con alcohol al 70% antes de llevarlas a la campana.
Instrumentos, pipetas
Esterilidad poco fiable	Utilice suministros envueltos individualmente, estériles y desechables de un proveedor acreditado. Esterilice los artículos reutilizables con calor seco antes de usarlos.
Contacto con una superficie o algún otro material no estériles	No agarre ninguna parte de un instrumento o pipeta que vaya a pasar a un recipiente de cultivo.
Frascos de cultivo y botellas de medios en uso
Polvo y esporas de la incubadora o el refrigerador	Utilice tapones de rosca en lugar de tapones a presión. Limpie las botellas antes de colocarlas en la campana. Utilice acondicionamiento secundario para las placas.
Condiciones sucias de almacenamiento o incubación	Cubra las tapas y los cuellos de las botellas con papel de aluminio durante el almacenamiento o la incubación. Limpie las zonas de almacén y las incubadoras con regularidad.
Medios debajo del tapón y extendiéndose hacia el exterior de la botella	Deseche todas las botellas que muestren derrames en la parte exterior del cuello. No vierta.
Equipos e Instalaciones
Aire ambiente
Corrientes de aire, remolinos, turbulencia, polvo, aerosoles	Dedique un espacio adecuado para el cultivo de tejidos o células. Reduzca el tráfico y la actividad extraña. Limpie el suelo y las superficies de trabajo con regularidad.
Cámaras de bioseguridad de flujo laminar
Filtro perforado	Revise los filtros regularmente para ver si hay agujeros y fugas.
Filtro sucio	Compruebe la caída de presión a través del filtro.
Derrames, particularmente en grietas o debajo de una superficie de trabajo	Desinfecte con regularidad alrededor y debajo de la superficie de trabajo. Deje que el alcohol entre en las grietas.
Incubadoras humidificadas de CO2
Crecimiento de mohos y bacterias en paredes y estantes en una atmósfera húmeda	Limpie regularmente de acuerdo con las especificaciones del fabricante con la desinfección adecuada.
Esporas, etc., transportadas por la circulación de aire forzado	Encierre las placas abiertas en cajas de plástico con tapas ajustadas (pero no precinte las tapas).
Baños y otros equipos
Contaminación de los baños María utilizados para calentar disoluciones	Limpie y desinfecte el baño de agua con regularidad; limpie bien los vasos con alcohol al 70 % antes de transferirlos a la cámara de bioseguridad para utilizarlos cuando estén secos.
Polvo en cilindros de gas, bombas, etc.	Considere utilizar un baño de calentamiento sin agua (microesferas). Limpie con alcohol al 70 % antes de entrar en la sala de cultivos.
Importación de materiales biológicos
Líneas celulares entrantes
Sospecha de contaminación en el origen o durante el tránsito	Maneje estas líneas celulares de manera individual, preferiblemente en cuarentena. Compruebe si hay contaminación cultivando durante dos semanas sin antibióticos. Inspeccione la contaminación visualmente, mediante microscopia de contraste de fase y tinción Hoechst/ DAPI para micoplasma.

Micoplasmas

Los micoplasma son un género de bacterias que no poseen paredes celulares y, por lo tanto, no se ven afectadas por los antibióticos que limitan el crecimiento bacteriano al inhibir la formación de las paredes celulares. Su morfología flexible y su tamaño celular en el intervalo de 0,15 a 0,3 µm implican que pueden escapar de los enfoques convencionales de filtración en los que suelen utilizarse filtros con poros de 0,22 µm. A diferencia de la mayoría de los otros contaminantes bacterianos, los micoplasmas no se pondrán de manifiesto por inspección casual y son difíciles de detectar al microscopio óptico debido a su morfología y su tamaño notablemente pequeño. Los micoplasmas en cultivo puede alcanzar los 10⁸organismos/ml sin causar turbidez en el medio. Por lo general, no matan las células de mamíferos que infectan, pero afectan significativamente a los cultivos al alterar el metabolismo celular, causar aberraciones cromosómicas, ralentizar el crecimiento celular e interferir en la fijación celular. En resumen, es probable que influyan notablemente en los resultados de la mayoría de los experimentos realizados utilizando líneas celulares afectadas.

Figura 2. Agentes habituales de detección de ADN como el DAPI o Hoechst revelan la presencia de micoplasmas en cultivos contaminados (derecha) utilizando el microscopio de fluorescencia.

Las diversas fuentes de contaminación por micoplasma en el laboratorio pueden representar un desafío. Dado que ciertas especies de micoplasma se encuentran en la piel humana, pueden introducirse a través de una técnica aséptica deficiente, además de a través de suplementos contaminados como el suero bovino fetal.  Los micoplasmas son muy transmisibles entre cultivos celulares contaminados vecinos. Para el tratamiento de los micoplasma es necesario filtrar los medios y las disoluciones tampón a través de membranas con poros de 0,1 µm, ya que las unidades de filtración convencionales con tamaños de poro de 0,22 o 0,45 µm no descartarán estos pequeños organismos.

Prevenir, detectar y eliminar la contaminación por Mycoplasma

Una vez que el micoplasma contamina un cultivo, puede propagarse rápidamente a otras áreas del laboratorio. El cumplimiento estricto de las buenas prácticas de laboratorio es fundamental y se recomienda vivamente el análisis sistemático de los micoplasmas para conseguir un control satisfactorio de la contaminación por micoplasmas. Los tres métodos más populares de detección son el cultivo de micoplasmas, el método de tinción del ADN y la detección mediante PCR. Ofrecemos una variedad de soluciones para la  detección y la eliminación de Mycoplasma. Es fundamental establecer una rutina para el cribado de los micoplasmas en los cultivos, aunque no se sospeche la presencia de este contaminante en el laboratorio.

Prevención de la contaminación microbiana:  ¿son los antibióticos la respuesta? En el cultivo de tejidos es habitual el uso sistemático de antibióticos, ya sean solos o en combinación con antifúngicos. Igual que ocurre con los antibióticos terapéuticos prescritos por los médicos, el uso continuo o inadecuado de antibióticos puede inducir el desarrollo de cepas resistentes que son difíciles de erradicar y pueden requerir el uso de antibióticos de última generación que pueden ser tóxicos para los cultivos celulares. Estudios recientes han inducido más preocupaciones sobre la posibilidad de alteración de la expresión génica en células cultivadas en presencia de antibióticos.

Contaminación vírica

Los virus se encuentran entre los contaminantes de los cultivos celulares más difíciles de detectar, que exigirían métodos de microscopia que serían poco prácticos para la mayoría de los laboratorios de investigación. Pueden proceder de las células del paciente o del animal hospedador, y se ha demostrado que varias líneas celulares de importancia biotecnológica contienen retrovirus endógenos.  Más a menudo, las células se infectan por los virus presentes en los materiales de origen animal utilizados para cultivarlos. El pequeño tamaño de los virus los hace muy difíciles de eliminar de los medios, sueros y otras disoluciones de origen biológico. Sin embargo, debido a que la mayoría de los virus están restringidos al hospedador e incluso el tejido, esto puede limitar su capacidad para causar infecciones entre especies o entre tejidos. Es probable que los virus sean más comunes en los cultivos celulares de lo que muchos investigadores creen, pero pueden o no representar un factor de confusión significativo para el cultivo celular si no inducen efectos citopáticos u otros efectos adversos en las células.

Más allá de su potencial para afectar a las células cultivadas, una de las principales preocupaciones del uso de cultivos celulares infectados por virus es el posible peligro que representan para la salud del personal del laboratorio. Siempre se deben tomar precauciones especiales de seguridad cuando se trabaja con tejidos o células de seres humanos u otros primates para evitar la posible transmisión de infección vírica (VIH, hepatitis B, Epstein-Barr, virus del herpes B simio, entre otros) de los cultivos celulares al personal de laboratorio. Debe consultarse a los funcionarios de seguridad medioambiental institucionales sobre los procedimientos recomendados para trabajar con tejidos, cultivos o virus potencialmente peligrosos. Si desea más información sobre la evaluación de riesgos para el personal de laboratorio que trabaja con cultivos celulares, pulse aquí

Mejores prácticas para reducir la incidencia de contaminación vírica en los cultivos celulares:
*Limite el número de fuentes biológicas (proveedores, animales) de las que se extraen las células.
*Seleccione animales/células que sean menos sensibles a virus.
*Fuente de células de repositorios que realizan pruebas de virus y proporcionan certificación de líneas celulares exentas de virus.

Contaminación química

Cualquier contaminante no vivo de un cultivo celular suele clasificarse como contaminante ‘químico’.  Estos contaminantes pueden proceder de los reactivos o el agua utilizados en los medios o las disoluciones tampón, o de equipos y suministros.  Son ejemplos los radicales libres, los iones metálicos, los residuos de desinfectantes o detergentes, o incluso las endotoxinas que persisten aunque ya no estén presentes los contaminantes bacterianos que las produjeron.

Consejos para prevenir la contaminación química:
*Utilice siempre agua de grado de laboratorio para preparar las disoluciones y las disoluciones tampón, y para resuspender reactivos liofilizados.
*Todo el material de laboratorio reutilizable debe enjuagarse exhaustivamente y secarse al aire; el autoclave no tendrá ningún efecto sobre los restos de detergente.
* Obtenga los medios, suplementos y suero (FBS, FCS) exclusivamente de proveedores que proporcionan certificación de pruebas de endotoxinas.

Consejos generales y técnicas para prevenir y eliminar la contaminación

Trabajar dentro de la cámara de seguridad biológica

Cuando se trabaja dentro de la cámara de bioseguridad, es útil recordar que el flujo de aire es clave para ayudar a mantener un ambiente estéril. Tanto las rejillas de ventilación trasera como las delanteras deben mantenerse despejadas en todo momento para lograr un flujo de aire eficaz. Antes de cualquier procedimiento práctico, debe abastecerse la cabina con todos los materiales necesarios para minimizar el potencial de transferencia de contaminantes en las mangas y las manos del operador.

Deben transcurrir al menos veinte minutos desde que se inicie el flujo de aire y se coloquen los artículos que se vayan a utilizar en la cabina. Todos los artículos que vayan a entrar en la cabina deben rociarse primero con alcohol estéril al 70 % (v/v) y secarse conpaños que no suelten pelusa para evitar la entrada de polvo y partículas en la cabina. Asegúrese de que el flujo de aire esté bien establecido antes de abrir las tapas o los recipientes para permitir que el flujo de aire purgue el área de trabajo de las partículas que puedan haberse introducido.

Figura 3. Trabajar en una cámara de seguridad

Pipeteo y prevención de aerosoles

Las pipetas de plástico desechables, también llamadas pipetas serológicas, disponibles en capacidades de 1a 100 ml, son herramientas indispensables para el cultivo celular. Vienen envueltas en envases individuales para garantizar la esterilidad. El cumplimiento de las siguientes directrices puede minimizar la contaminación y los riesgos de seguridad asociados al pipeteo.

• Utilice pipeteadores automáticos, restringiendo el uso de cada pipeteador a una sola cabina.  Para evitar la contaminación, desmonte y desinfecte las piezas del pipeteador automático con regularidad. Asegúrese de tener siempre una buena reserva de filtros del pipeteador y cámbielos con regularidad.
• Use pipetas taponadas (taponadas en la parte superior con algodón) siempre que sea posible, en especial cuando se transfiera medio,   y evite introducir líquido en el tapón. Si el tapón se humedece accidentalmente, cambie de inmediato el filtro del pipeteador automático.
• Evite tocar la pipeta serológica desenvolviéndola parcialmente y colocando el extremo en el pipeteador automático para quitar luego el resto de la funda de papel.
• Para evitar generar aerosoles contaminantes, no produzca burbujas en el medio ni en la pipeta.
  

Desinfección

Los métodos diseñados para desinfectar o descontaminar los residuos de los cultivos, superficies de trabajo y equipos no solo deben minimizar el riesgo de contaminación, sino que deben ser seguros para el personal de laboratorio. Lleve siempre puesto equipo de protección personal (EPP) apropiado, como guantes y protección ocular, cuando emplee formas concentradas de los desinfectantes. Los guantes seleccionados deben proteger contra la sustancia que se esté manipulando. Las tablas de los fabricantes ayudarán a identificar los mejores guantes para una tarea determinada. Los principales desinfectantes se dividen en grupos, y sus méritos relativos se pueden resumir de la siguiente manera:

Hipoclorito de sodio o lejía

• Buen desinfectante general
• Activo contra virus
• Corrosivo contra metales: no debe usarse en superficies metálicas como centrifugadoras
• Inactivado fácilmente por la materia orgánica, por lo que debe prepararse nuevo con frecuencia
• Utilice lejía comercial para crear una disolución al 10% (v/v) en líquido de desecho o para la desinfección de superficies

Alcohol (por ejemplo, etanol, isopropanol)

• Concentraciones efectivas: 70 % para el etanol, 60-70 % para el isopropanol
• Eficaz contra las bacterias. El etanol es eficaz contra la mayoría de los virus, pero no contra los virus no encapsulados
• El isopropanol no es eficaz contra los virus
• Los aldehídos son irritantes, y su uso debe ser limitado

Deben evitarse los desinfectantes a base de fenoles, ya que no están respaldados como parte del programa de revisión de la Directiva de la UE sobre biocidas.

Cómo realizar el control sistemático de las células sanas

La supervisión de los cultivos celulares es una parte importante del cultivo celular diario. Este tutorial contribuirá a explicar los conceptos básicos de supervisión de las células: qué aspecto tiene un cultivo saludable, la confluencia celular y las diferentes fases del crecimiento de un cultivo celular. En este video encontrará también indicadores comunes de contaminación bacteriana y por micoplasmas.

Productos relacionados

Medios de cultivo	Suero bovino fetal	Detección de micoplasmas	Puntas de pipeta	Matraces para cultivo
Tripsina	Antibióticos	Colorante de tinción Hoechst	Alcohol etílico	Pipetas automáticas
Esterilización por filtración	Líneas celulares autenticadas	Alcohol isopropílico

Referencias bibliográficas

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