Análisis de viabilidad y proliferación celulares
- Análisis de proliferación a través de la síntesis de ADN
- Análisis de proliferación metabólica
- Análisis luminiscente de la viabilidad celular
- Análisis de proliferación mediante colorantes fluorescentes
- Cultivo celular en 3D: tinción triple de células vivas/muertas/totales -
- Recuento de células con azul de tripano
Introducción
Habitualmente se utilizan análisis para medir la proliferación y la viabilidad celulares, así como la citotoxicidad con objeto de controlar la respuesta y la salud de las células en cultivo después de tratamiento con diversos estímulos. La elección apropiada de un método de análisis depende del número y el tipo de células utilizadas así como del resultado esperado. En los análisis de proliferación celular puede controlarse el número de células a lo largo del tiempo, el número de divisiones celulares, la actividad metabólica o la síntesis de ADN. El recuento celular utilizando colorantes de viabilidad como el azul de tripano o la calceína AM puede proporcionar tanto la tasa de proliferación como el porcentaje de células viables.
Descripción general de los análisis de viabilidad y proliferación celulares
Análisis de proliferación a través de la síntesis de ADN
Análisis de proliferación celular con BrdU
La proliferación celular se puede estudiar controlando la incorporación de un radioisótopo, la [3H]-timidina, en el ADN celular, seguido de autorradiografía. Otra alternativa es utilizar el 5-bromo-2′-desoxiuridina (análisis con BrdU) en lugar de timidina. Las células que han incorporado BrdU en su ADN se detectan fácilmente utilizando un anticuerpo monoclonal contra la BrdU y un anticuerpo secundario conjugado con una enzima o un fluorocromo.
Figura 1.A, células proliferantes en el ojo del embrión de pollo E4 utilizando la tinción de BrdU, A, validación de anticuerpos anti-BrdU utilizando camptotecina. Al tratar las células Jurkat con el agente de parada del ciclo celular camptotecina, las células circulantes quedan atrapadas en la transición de fase G1/S.
Análisis de proliferación con EdU
Los análisis de proliferación Baseclick EdU proporcionan un método eficiente para la detección de fluorescencia en ADN en replicación. El nucleósido modificado EdU se agrega a las células vivas y se incorpora al ADN en replicación. La química clic inducida por Cu permite una rápida fijación de sondas fluorescentes a la EdU. Esto proporciona una forma cuantitativa de controlar las células que están proliferando. Los ensayos están disponibles en varios formatos para obtención de imágenes microscópicas, citometría de flujo, cribado de alto rendimiento y experimentos in vivo. Se dispone de cuatro sondas fluorescentes diferentes con picos de excitación en 488, 555, 594 y 647 para capacidad de multiplexación con otras sondas fluorescentes.
Figura 2.Los kits de proliferación celular Edu-Click incorporan EdU (5-etinil-2’-desoxiuridina) en el ADN durante la síntesis activa del ADN, que se mide utilizando un método de detección fluorescente de química clic.
Análisis de proliferación metabólica
Los análisis que miden la actividad metabólica son adecuados para analizar la proliferación celular, la viabilidad celular y la citotoxicidad. La reducción de sales de tetrazolio como MTT, XTT yWST-1 a compuestos formazán coloreados o la biorreducción de la resazurina sólo se producen en las células metabólicamente activas. Las células en proliferación activa aumentan su actividad metabólica, mientras que las células expuestas a toxinas tendrán una actividad reducida.
Análisis de proliferación celular con MTT
El MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio; azul de tiazolio) es una sal de tetrazolio hidrosoluble que produce una disolución amarillenta cuando se prepara en medios o disoluciones salinas que carecen de rojo fenol. El MTT disuelto se convierte en un formazán púrpura insoluble por la escisión del anillo tetrazolio causada por enzimas deshidrogenasa. Este formazán insoluble en agua puede solubilizarse utilizando isopropanol u otros disolventes, y el material disuelto se mide espectrofotométricamente usando la absorbancia como una función de la concentración del colorante convertido.
Análisis de proliferación celular con XTT
A diferencia del MTT, el producto de escisión del XTT es hidrosoluble, por lo que no se requiere un paso de solubilización. La sal de tetrazolio XTT es escindida a formazán por un mecanismo celular complejo. Esta biorreducción se produce sólo en células viables, y está relacionada con la producción de NAD(P)H a través de la glucólisis. Existe una correlación directa entre la cantidad del colorante formazán formado y el número de células metabólicamente activas en el cultivo.
Análisis de proliferación celular con WST-1
La sal de tetrazolio estable WST-1 es escindida a un formazán soluble mediante un complejo mecanismo celular que se produce principalmente en la superficie de la célula. Esta biorreducción depende en gran medida de la producción glucolítica de NAD(P)H en las células viables. Existe una correlación directa entre la cantidad del colorante formazán formado y el número de células metabólicamente activas en el cultivo.
Guía de protocolos: Análisis de WST-1 para viabilidad y proliferación celulares. Protocolos, preguntas frecuentes y resolución de problemas
Figura 3.El análisis con MTT es un ensayo colorimétrico para evaluar la proliferación celular en función de la actividad metabólica. Las enzimas oxidorreductasas celulares dependientes del NAD(P)H reflejan el número de células viables presentes. Estas enzimas son capaces de reducir el colorante de tetrazolio amarillo MTT bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio a su formazán insoluble, que tiene un color púrpura.
Análisis luminiscente de la viabilidad celular
Dado que el ATP es un indicador de células metabólicamente activas, el número de células viables puede evaluarse en función de la cantidad de ATP disponible. El análisis de viabilidad celular con luciferasa y ATP ofrece un ensayo homogéneo muy sensible para cuantificar el ATP en los cultivos celulares. En este kit se emplea la luciferasa de luciérnaga para oxidar la D-luciferina y la producción resultante de luz para evaluar la cantidad de ATP disponible en cultivos celulares. El procedimiento de este sensible análisis implica la agregación única de cóctel de detección de ATP directamente a las células cultivadas en un medio enriquecido con suero. No se requiere lavado de las células, eliminación del medio ni varios pasos de pipeteo. El kit es lo suficientemente sensible como para permitir la detección de una sola célula o 0,01 picomoles de ATP. La señal producida es lineal dentro de seis órdenes de magnitud. Al relacionar la cantidad de ATP con el número de células viables, el ensayo tiene amplias aplicaciones, que van desde la determinación del número de células viables hasta la proliferación celular y la citotoxicidad celular.
Figura 4.Análisis bioluminiscente de viabilidad celular con ATP y luciferasa. Uso de la luciferasa de luciérnaga para oxidar la D-luciferina y la producción resultante de luz con el fin de evaluar la cantidad de ATP disponible que se correlaciona con el número de células y la viabilidad.
Análisis de proliferación mediante colorantes fluorescentes
Etiquetas CFSE
El éster N-succinimidílico de diacetato 5(6)-carboxifluoresceína (CFSE) es una opción popular para medir el número de divisiones experimentadas por una población celular. Tras entrar en la célula, las esterasas intracelulares cortan el CFSE para formar el compuesto fluorescente, y el grupo éster succinimidílico reacciona covalentemente con las aminas primarias de las proteínas intracelulares. Tras la división, la intensidad de la fluorescencia de cada célula hija se reduce a la mitad, permitiendo la detección sencilla del número de divisiones celulares por citometría de flujo. El CFSE se ha utilizado ampliamente para medir la proliferación de linfocitos, entre ellos las células T.
Doble tinción de células vivas y muertas
La tinción doble de células vivas o muertas se puede utilizar para la detección simultánea de fluorescencia en células viables y muertas. La Calceína-AM es un colorante muy lipófilo y permeable a la membrana celular. Si bien la calceína-AM en sí misma no es una molécula fluorescente, la calceína generada a partir de la calceína-AM por esterasas en una célula viable emite una fluorescencia verde fuerte (λex 490 nm, λem 515 nm). Por consiguiente, la calceína-AM solo tiñe las células viables. Por el contrario, el colorante de tinción de los núcleos, el yoduro de propidio, no puede atravesar una membrana celular viable. Alcanza el núcleo atravesando áreas desordenadas de la membrana de células muertas, y se intercala en la doble hélice del ADN para emitir fluorescencia roja (λex 535 nm, λem 617 nm). Dado que tanto la calceína como el PI-ADN pueden excitarse con luz de 490 nm, es posible el control simultáneo de células viables y muertas con un microscopio de fluorescencia de excitación.
Figura 5.Doble tinción de células vivas y muertas
Cultivo celular en 3D: tinción triple de células vivas/muertas/totales -
El kit de imágenes de viabilidad celular es un ensayo de tres colores que se puede utilizar con cultivos celulares en 2D y 3D para la tinción fluorescente simultánea de células viables (calceína-AM), células muertas (yoduro de propidio/PI) y células totales (Hoechst 33342).
- La calceína-AM emite fluorescencia verde al unirse al calcio, dependiendo de la actividad esterasa presente solo en células viables metabólicamente activas.
- El yoduro de propidio (PI) es un colorante nuclear que es excluido por la membrana de las células vivas, pero que atraviesa la membrana dañada de las células muertas, intercalándose en el ADN para emitir una fluorescencia roja fuerte.
- Hoechst 33342 es un colorante de tinción del ADN que exhibe baja citotoxicidad. Emite fluorescencia azul y se utiliza como un indicador del recuento total de células.
Recuento de células con azul de tripano
El azul de tripano es uno de los varios colorantes recomendados para utilizar en procedimientos de exclusión de colorantes con el fin de contar células viables. Este método se basa en el principio de que las células vivas (viables) no captan el colorante azul, mientras que las células muertas (no viables) sí lo hacen. La viabilidad celular se puede calcular utilizando el cociente de células vivas totales/células totales (vivas y muertas). La tinción también facilita la visualización de la morfología celular general.
NOTA: el azul de tripano tiene una mayor afinidad por las proteínas séricas que por las proteínas celulares. Si el fondo es demasiado oscuro debido a la presencia de suero en la matriz, las células deben ser sedimentadas y resuspendidas en medio exento de proteínas o en disolución salina antes de contar.
Referencias bibliográficas
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