Lisis celular y extracción de proteínas para Western Blotting

Todos las etapas para la extracción de proteínas de las células o los tejidos (frescos o congelados) deben realizarse a 2-8 °C. La que se indica a continuación es la composición de un tampón de lisis común que se utiliza para preparar muestras proteicas. En la página Calculadoras encontrará una lista de recetas para disoluciones tampón y otras disoluciones para transferencia Western.

Tampón RIPA para disolución de extracción de proteínas lista para usar (N.º de referencia R0278)

• NaCl(S3014) 150 mM
  
• Triton X-100(T8787) 1 %
  
• Desoxicolato de sodio(D6750) 0,5 %
  
• SDS (74255) 0,1 %
  
• Tris-HCl(T1503) pH 8,0, 50 mM

Inhibidores de proteasas: no pierda sus proteínas durante la preparación de la muestra

Etapas del protocolo de extracción de proteínas

1. Deseche el medio de las placas de cultivo con células y lave las células usando PBS frío.
   
2. Deseche el PBS, agregue tampón de lisis frío.
   
3. Raspe las células usando el raspador de células de plástico frío. Recoge las células en tubos de microcentrífuga.
   
4. Agite el contenido en tubos de microcentrífuga durante 30 min a 4 °C.
   
5. Centrifugue los tubos a 16 000 x g durante 20 minutos a 4 °C. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo y colóquelo en hielo. Deseche el sedimento.

Extracción de proteínas de las células en suspensión

1. Centrifugue la suspensión celular a 2 000 x g durante 5-7 min a 4 °C. Las células se acumulan en el fondo del tubo, deseche el sobrenadante.
   
2. Agregue PBS helado al sedimento celular y lave las células centrifugando a 2 000 x g durante 5-7 min a 4 °C.
   
3. Agregue el tampón de lisis frío al sedimento celular. Agite el contenido en tubos de microcentrífuga durante 30 minutos a 4 °C.
   
4. Centrifugue los tubos a 16 000 x g durante 20 minutos a 4 °C. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo y colóquelo en hielo. Deseche el sedimento.

Extracción de proteínas de los tejidos

1. Diseccione el tejido de interés en hielo. Transfiera el tejido a tubos de microcentrífuga de fondo redondo y congele rápidamente sumergiéndolos en nitrógeno líquido.
   
2. Para 5 mg de tejido, agregue 300 µl de tampón de lisis frío y homogeneice utilizando un homogeneizador eléctrico. Agregue otros 300-600 µl de tampón de lisis durante la homogeneización.
   
3. Agite el contenido durante 2 h a 4 °C.
   
4. Centrifugue los tubos a 16 000 x g durante 20 minutos a 4 °C. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo y colóquelo en hielo. Deseche el sedimento.

Normalización de la concentración total de proteínas de las muestras

1. Tome un pequeño volumen del lisado para realizar un ensayo de estimación de proteínas.
2. Determine la concentración de proteínas de muestras desconocidas en comparación con los patrones, cerciorándose de que el patrón se ha diluido en el mismo tampón que las muestras desconocidas. La estimación de la proteínas se puede realizar utilizando el reactivo de análisis de proteínas Coomassie(N.º de referencia27813), ensayo BCA, absorbancia a 280 nm.
3. Transfiera el volumen apropiado de lisados a los tubos de microcentrífuga para que todas las muestras contengan la misma concentración total de proteínas.
   
4. Agregue el tampón de lisis frío adecuado para que todos los lisados tengan el mismo volumen.

Mezcle las muestras con tampón de carga Laemmli

La siguiente es la composición del tampón de carga necesario para preparar las muestras para la electroforesis.

Tampón de carga Laemmli X2:

• Azul de bromofenol (Nº de referenciaB5525) 0,004 %
• 2-mercaptoetanol al 10 %
• Glicerol(N.º de referenciaG5516) 20 %
• SDS(Nº de referencia74255) 4 %
• Tris-HCl(N.º de referenciaT1503) 0,125 M

1. A un volumen de lisado celular, agregue el mismo volumen de tampón de carga.
   
2. Hierva la mezcla anterior a 95 °C durante 5 minutos. Centrifugue a 16 000 x g durante 5 minutos.
   
3. Estas muestras se pueden conservar a -20 °C o se pueden utilizar para proceder con la electroforesis en gel.