Introducción a la SDS-PAGE - Separación de proteínas basada en el tamaño

Los geles de poliacrilamida se forman por la reacción de la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metilenobisacrilamida) que produce una matriz de gel muy reticulada. El gel actúa como un tamiz a través del cual se mueven las proteínas en respuesta al campo eléctrico. Las proteínas contienen una carga global positiva o negativa; esto permite el movimiento de una molécula de proteína hacia el punto isoeléctrico en el cual la molécula no tiene carga neta. Al desnaturalizar las proteínas y proporcionarlas una carga negativa uniforme, es posible separarlas en función de su tamaño a medida que migran hacia el electrodo positivo.

Figura 1. SDS-PAGE de muestras proteicas y marcador de proteínas con explosión de color(C1992)

Protocolo

Materiales y reactivos requeridos

• Cámara de electroforesis vertical con fuente de alimentación, placas de vidrio, espaciadores y peines

Reactivos necesarios	Componentes del reactivo	Referencia del producto
Disolución de acrilamida/bisacrilamida	Acrilamida  29,2 g Bisacrilamida 0,8 g	01696 M7279
Tampones para preparación del gel	Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 (para preparar el gel separador): Disuelva 18,15 g de base Tris en 80 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 8,8 usando HCl 6N. Complete el volumen final hasta 100 ml con agua destilada. Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (para preparar gel concentrador): Disuelva 6 g de base Tris en 80 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 6,8 usando HCl 6N. Complete el volumen final hasta 100 ml con agua destilada.	93362
Tampón de carga Laemmli X2	Azul de bromofenol 0,004% 2-mercaptoetanol 10% Glicerol 20 % SDS4% Tris-HCl 0,125 M	B5525 M3148 G5516 L3771 93362
10X Tampón de migración	Tris-HCl 25 mM Glicina 200 mM SDS 0,1 % (p/v)	93362 G8898 L3771
SDS al 10 %	SDS	L3771
Persulfato de amonio 10 %	Persulfato de amonio	A3678
TEMED	TEMED	T9281

NOTA: La acrilamida y la bisacrilamida son de naturaleza neurotóxica. Todos los pasos deben realizarse con guantes exentos de polvo.

Preparación del gel

• Limpie las placas de vidrio y los espaciadores de la unidad de preparación del gel con agua desionizada y etanol.
• Monte las placas con los espaciadores en una superficie estable y uniforme.
• Prepare la disolución de gel separador utilizando los siguientes volúmenes (para 10 ml) dependiendo del porcentaje de gel requerido.

% de gel	Agua (ml)	30% acrilamida (ml)	Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 (ml)	SDS al 10% (µl)	APS al 10 % (µl)	TEMED*(µl)
8%	4,6	2,6	2,6	100	100	10
10%	3,8	3,4	2,6	100	100	10
12%	3,2	4,0	2,6	100	100	10
15 %	2,2	5,0	2,6	100	100	10
*TEMED debe ser el último ingrediente en ser añadido

• Vierta la disolución de gel en las placas montadas con los espaciadores. Para mantener una superficie de gel separador uniforme y horizontal, cubra la superficie con agua o isopropanol (I9516).
  
• Deje fijar el gel durante unos 20-30 minutos a temperatura ambiente.
  
• Prepare la disolución de gel concentrador utilizando los siguientes volúmenes (para 10 ml):
  

% de gel	Agua (ml)	30% acrilamida (ml)	Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (ml)	SDS al 10% (µl)	APS al 10 % (µl)	TEMED*(µl)
5 %	5,86	1,34	2,6	100	100	10

*TEMED debe ser el último ingrediente en ser añadido

• Deseche el agua o el isopropanol superpuesto sobre el gel separador
• Agregue disolución de gel concentrador al 5 % hasta que se desborde. Introduzca inmediatamente el peine asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas en el gel o cerca de los pocillos.
• Deje fijar el gel durante unos 20-30 minutos a temperatura ambiente.
  

Preparación de las muestras

• A un volumen de muestra de proteínas (lisado celular o tisular), agregue el mismo volumen de tampón de carga.
  
• Hierva la mezcla anterior a 95 °C durante 5 min. Centrifugue a 16000 x g durante 5 minutos.
  
• Estas muestras se pueden conservar a -20 °C o se pueden utilizar para proceder con la electroforesis en gel.

Tinción del gel

Tinción con azul de Coomassie: La tinción de los geles proteicos con azul brillante de Coomassie R-250 es un procedimiento común para visualizar las proteínas resueltas en SDS-PAGE. Es muy sensible y es adecuada para la conservación prolongada de los geles.

Reactivos necesarios

• Disolución de fijación del gel (500 ml)
  
       Metanol (M3641) 250 ml
       Ácido acético glacial (695092) 50 ml
      Agua, 200 ml
  
  
• Disolución de Coomassie
  
       CBB R-250 (B6529) 0,1 %
       Metanol (M3641) 40 %
       Ácido acético glacial(695092) 10 %
       Filtre la disolución de tinción utilizando papel filtrante Whatmann n.º 1.
  
  
• Disolución decolorante
  
       Metanol(M3641) 50 ml
       Ácido acético glacial (695092) 35 ml
  
  
• Solución de almacenamiento de gel
  
       Ácido acético glacial(695092) 25 ml
       Agua, 475 ml

Procedimiento

• Después de la electroforesis, coloque el gel en una bandeja de plástico que contenga la disoluciones de fijación. Coloque la bandeja en una plataforma basculante y deje fijar las proteínas durante 2 horas.
  
• Retire la disolución de fijación del gel y agregue la disolución de Coomassie.  Colóquelo en una plataforma basculante y tiña el gel durante 2-4 horas.
  
• Después de la etapa de tinción, lave el gel varias veces con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
  
• Añada la disolución decolorante al gel. Colóquelo en la plataforma basculante y deje decolorar durante aproximadamente 4 horas hasta que se vean bandas azules claras sobre fondo claro.
  
• Después de decolorarlos, los geles pueden conservarse en disolución de almacenamiento de gel y fotografiarse según necesidad.

Tinción con plata

Ofrecemos un kit de tinción con plata muy sensible para la detección de proteínas adecuado para geles SDS-PAGE. Además, se necesitan los siguientes reactivos:

• Disolución de fijación
  
       Etanol (E7023), 50 ml
  Ácido acético, 10 ml
       Agua, 40 ml
  
  
• Disolución de etanol al 30 % (E7023)

Procedimiento

• Después de la migración electroforética sumerja el gel en la disolución de fijación durante 40 minutos. La inmersión nocturna en el fijador producirá un fondo más claro.
  
• Retire la disolución de fijación y lave el gel durante 10 minutos con una disolución de etanol al 30% seguido de un lavado con agua ultrapura durante 10 minutos.
  
• Decante el agua e incube el gel en una disolución sensibilizadora durante 10 minutos.
  
• Retire la disolución sensibilizadora y lave el gel dos veces con agua, 10 minutos de duración cada lavado.
  
• Decante el agua y sumerja el gel durante 10 min en disolución de plata.
  
• Decante la disolución de plata y lave el gel en agua durante 1,5 minutos.
  
• Deseche el agua y sumerja el gel en una disolución reveladora durante 3 a 7 minutos.
  
• Agregue 5 ml de disolución de parada al revelador e incube durante 5 minutos. Retire la disolución reveladora/de parada y lave el gel en agua ultrapura durante 15 minutos.
  
• El gel se puede fotografiar y también conservar en agua ultrapura recién producida.

Para una tinción doble, tiña el gel con CBB R-250 seguido de la tinción de plata usando los procedimientos anteriores.

Tinciones fluorescentes: Ofrecemos las tinciones fluorescentes SYPRO y Lucy para la electroforesis de proteínas. Los geles pueden sumergirse en la tinción fluorescente en la oscuridad o bien el gel se puede mezclar con el tampón catódico durante la electroforesis.

Los protocolos de tinción dependerán del colorante que se utilice y los puede encontrar aquí:

• Colorante de gel de proteínas SYPRO^® Ruby(PDF)
  
• Disolución LUCY^® 506(PDF)
  

Tinción reversible del gel

Las tinciones reversibles del gel permiten al usuario proceder a la inmunoelectrotransferencia (western blot) de las proteínas después de la SDS-PAGE.

Tinción R-PROB: R-PROB es un colorante único que detecta proteínas en los geles de PAGE y las transferencias western.

Reactivos necesarios:

• Kit reversible de detección de proteínas para membranas y geles de poliacrilamida(RPROB)
  
• Disolución de fijación (F7264)
  
• Ácido acético al 10 %
  
• EDTA 50 mM

Procedimiento

• Sumerja los geles después de la electroforesis en disolución fijadora durante 20 minutos. Repita este paso dos veces.
  
• Enjuague el gel en agua dos veces; cada lavado dura 30 minutos.
  
• Incube el gel en la disolución colorante durante 20-40 minutos con agitación suave.
  
• Lave el exceso de colorante en ácido acético al 10 %.
  
• Para decolorar, lave el gel con EDTA seguido de dos lavados de 15 minutos cada uno en agua o disolución de fijación.

Tinción de cobre: Para confirmar la migración y la separación de las proteínas, el gel puede teñirse con una tinción reversible como el CuCl₂.

Reactivos necesarios

• Disolución de CuCl₂  0,3 M
  
• Disolución Tris 0,25 M EDTA 0,25 M

Procedimiento

• Enjuague los geles después de la electroforesis en agua destilada durante un máximo de 30 minutos.
  
• Sumerja el gel en la disolución de CuCl₂  0,3 M durante 10 minutos.
  
• Enjuague con agua desionizada.
  
• Las proteínas se pueden visualizar como zonas claras en un fondo azul.
  
• Para decolorar el gel por completo para la inmunoelectrotransferencia, lave los geles teñidos en disolución Tris 0,25 M y EDTA 0,25 M, pH 9, repetidamente.
  
• Mueva el gel decolorado al tampón de transferencia antes de proceder con el montaje de la transferencia.

Figura 2. Sistema de transferencia y electroforesis vertical

Si desea transferir las proteínas a una membrana después de la electroforesis, encontrará el protocolo aquí.

Método

1. Sambrook J, Fritsch T, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.