半乾式或槽式電轉移故障排除

電轉移是指將蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）轉移到Immobilon^® PVDF轉移膜上的標準程序。常用的兩種電轉移技術是槽式轉移和半乾式轉移。兩者的原理相同，差別只在於用來固定凝膠/膜堆的機械裝置和電場的應用。

點選半乾式或槽式電轉移的症狀，閱讀可能的原因和補救方法：

• 色帶塗抹/扭曲
  
無訊號

• 小分子量蛋白質轉移差
• 大分子量蛋白轉移差 (~ & >80 kDa）
  
• 帶正電荷蛋白質的不良轉移
  
• 半乾轉移差
  
• Poor Transfer of a Wide Range of Protein Sizes
  

色帶剝落/失真

	整個膜必須預先用甲醇濕潤；整個膜應均勻地從不透明變成半透明。
膜下及堆疊中其他層間的氣泡 在 Western blot 轉移步驟中，凝膠與膜之間的氣泡的影響<	使用移液管或攪拌棒，在組裝堆疊時輕輕地滾出任何滯留的氣泡。
確保整個凝膠和膜表面接觸良好。
運轉溫度不應超過 20 °C。對於槽式轉移，請預先冷卻緩衝液或在冷室中進行轉移。對於半乾式轉移，可縮短運行時間、增加濾紙數量或降低電流。
半乾式轉移時濾紙乾燥	確保在轉印前徹底浸透濾紙，或使用額外的濾紙。確保在 15 分鐘內完成堆疊組裝。
蛋白質轉移過快；蛋白質積聚在膜表面	降低電場強度。

螢光檢測中的高背景

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Possible Cause	補救方法
轉移時使用低自發螢光膜，例如 Immobilon®-FL 膜。 Reverse image demonstrating fluorescent detection of transferrin in human serum on various Western blot transfer
透過降低電壓多達50%，增加蛋白質與膜互動的時間。 帶有高負電荷的蛋白質（由於天門冬氨酸和谷氨酸含量高）傾向於在電場中快速移動。降低電壓可減緩這些蛋白的移動速度。 凝膠中 SDS 的存在可能會抑制蛋白的結合。在轉移緩衝液中平衡凝膠至少 15 分鐘 凝膠（上）和印跡（下）顯示平衡提高了 Western 印跡的轉移效率。增加甲醇至 15 - 20%，尤其是對於分子量較小的蛋白質。 膜必須用甲醇預先濕透；整張膜應均勻地從不透明轉變為半透明。 轉用 Immobilon®-PSQ 轉移膜。
如果轉移緩衝液中的甲醇濃度過高，會去除蛋白質中的SDS，導致蛋白質在凝膠中沉澱。這會降低大分子量蛋白質轉移出凝膠的速度。如果蛋白質沉澱是一個問題，可以在轉移緩衝液中加入 SDS（0.01% - 0.05%）來幫助溶解。此外，過量的甲醇會使凝膠縮小或收緊，進而抑制大分子量蛋白質的轉移。
蛋白質的等電位點等於或接近轉移緩衝液的 pH 值 等電位點與轉移緩衝液的 pH 值相同的蛋白質將不帶淨電荷，因此不會在電場中移動。為了促進轉移，請嘗試使用較高 pH 值的緩衝液，例如 pH 11 的 10 mM CAPS 緩衝液，包括 10%的甲醇或較低 pH 值的緩衝液，例如醋酸緩衝液。
凝膠和/或轉移緩衝液中使用尿素時，檢測效果不佳	使用循環緩衝設定來降低溫度，或在冷室中進行轉移。尿素在高溫下會造成蛋白質的氨甲酰化，這會改變蛋白質中胺基酸的電荷。這可能會影響抗體識別和結合所必需的表位。
染色凝膠，檢查是否有殘留蛋白質。如果轉移不完全，請檢視您的轉移技巧。
一旦轉移完成，請務必完全乾燥膜，以獲得蛋白質的最佳結合與固定。這應該在任何下游檢測方法之前完成。

無訊號

Possible Cause                      ；	補救
在轉移過程中檢查凝膠和膜的方向。 使用預先染色的分子量標準來監控轉移。

小分子量蛋白轉移不良

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可能的 ；原因               nbsp;           nbsp;	蛋白質保留不足 SDS 干擾 小分子量蛋白質的結合	改用 Immobilon®-PSQ轉移膜。 移除轉移溶液中的 SDS。
轉移緩衝液中的甲醇濃度低	在轉移緩衝液中使用較高百分比的甲醇 (15% - 20%)。
較低的電壓可能會使小蛋白質與膜的結合最佳化。
電流無法穿透膜	完全按照凝膠尺寸裁切膜和吸墨紙；不允許懸垂。 探索預先切好的膜和濾紙三明治

大分子量蛋白轉移不良 (~ >80 kDa)

可能的 原因            nbsp;	甲醇濃度太高	將甲醇濃度降低到 10% (v/v) 或更低，應該可以讓凝膠膨脹，有助於大分子量蛋白質的轉移。此外，較低的甲醇百分比也可減少蛋白質中 SDS 的流失，並減少蛋白質在凝膠中的沉澱。蛋白質 >200 kDa 在與膜結合時，對 SDS 的干擾不如蛋白質 <100 kDa 般敏感。

帶正電的蛋白質轉移不佳

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Possible Cause                  ；	轉移緩衝區中的蛋白質淨電荷為正 ；蛋白質向陰極移動。	反轉轉移堆疊，使 Immobilon® 轉移膜在凝膠的陰極一側。

差半乾轉印

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補救方法
確保膜和吸墨紙完全依照凝膠尺寸裁切，並且沒有懸空。 探索預先切好的膜和濾紙三明治

大範圍蛋白質轉移不良

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可能的 ；原因               nbsp;	和小蛋白質所需的條件不同	使用三缓冲系统进行半干转移（查看蛋白印跡手冊 (PDF)。)