利用 GC-MS 對氨基酸進行衍生和分析

Katherine K. Stenerson

Reporter US Volume 25.3

引言

氨基酸的分析通常使用高效液相色譜 (HPLC)。然而，GC 也可以使用，而且在某些情況下，儀器的可用性或操作成本會使其成為更好的選擇。氨基酸的極性需要在 GC 分析前進行衍生化。衍生化的目的是使分析物更易揮發、活性更低，從而改善其色谱行為。就氨基酸而言，衍生化是以非極性分子取代 OH、NH2 和 SH 極性官能基上的活性氫。

Section Overview

• Experimental
• 結果
• 參考文獻

硅烷化是一種非常常見的衍生化技術，適用於多種化合物。這種方法的主要缺點是對濕氣敏感。濕氣的存在會導致反應收率低，衍生化的分析物不穩定。在本研究中，我們評估了使用硅烷化試劑 N-叔丁基二甲基硅烷-N-甲基三氟乙酰胺 (MTBSTFA) 來衍生氨基酸。MTBSTFA 在與含有活性氫的極性官能基團反應時會形成叔丁基二甲基硅烷 (TBDMS) 衍生物：

圖 1. MTBSTFA 的結構

MTBSTFA 衍生物比使用低分子量試劑（例如 N,O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺 (BSTFA) (1）形成的衍生物更穩定，且對濕氣的敏感性更低。

實驗性

將 50 μL 等分溶液（含 91 μg/mL 的 L- 氨基酸混合物）在 0.1 N HCl 的混合溶液，然後加入 100 μL 的純 MTBSTFA，再加入 100 μL 的乙腈。混合物在 100 °C 下加熱 4 小時。然後使用碳酸氫鈉中和樣品，並使用 20 m x 0.18 mm I.D. x 0.18 μm SLB™-5ms 毛細管柱進行 GC-MS 分析。

結果

氨基酸的 TBDMS 衍生物色譜圖見 圖 2。從這些峰值獲得的光譜資料有助於鑑定氨基酸衍生物。用 TBDMS 基取代活性氫會使分子量增加 114。這些衍生物的電子撞擊光譜 (2) 包含與衍生物分子量相對應的典型片段，減去 CH₃ (M-15)、C₄H₉ (M-57)、C₄H₉ + CO (M-85) 和 CO-O-TBDMS (M-159)。 圖 3 顯示了 TBDMS-valine 光譜中這種碎片模式的範例。

圖 2. GC-MS 分析 SLB-5ms 上的氨基酸衍生物 (28564-U)

圖 3. 纈氨酸的 TBDMS 衍生物質譜（衍生物的 MW = 345）

在所使用的反應條件下，大部分的氨基酸都會產生一種衍生物，羥基、胺基和硫醇基上的活性氫（半胱氨酸的情況）會被 TBDMS 取代。有些氨基酸會產生多種衍生物，特別是天門冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸。在這些胺基酸的情況下，改變反應條件，例如降低溫度或改變反應時間，就可以防止這種情況發生 (3)。

儘管 TBDMS 衍生物比傳統的 TMS 衍生物更穩定，但其較高的分子量導致 GC 分析過程中的洗脫時間較長。為了平衡這一點，我們使用短窄管徑的毛細管色譜柱進行分離。起始溫度必須不高於 100 °C，以維持甘氨酸衍生物峰與溶劑的分離。

結論

本研究證明，只要適當使用衍生化試劑 (例如 MTBSTFA)，就能利用 GC-MS 分析氨基酸。反應條件可能需要 「調整」，以產生所需衍生物的最大反應。這些衍生物會產生特徵性的片段，使 MS 鑑定變得容易。為了縮短這些衍生物的整體 GC 分析時間，建議使用窄管徑的短柱，例如 20 m x 0.18 mm I.D. x 0.18 μm SLB-5ms。

參考資料

1. Sobolevsky TG, Revelsky AI, Miller B, Oriedo V, Chernetsova ES, Revelsky IA. 2003. Comparison of silylation and esterification/acylation procedures in GC-MS analysis of amino acids. J. Sep. Science. 26(17):1474-1478. https://doi.org/10.1002/jssc.200301492

2. Kitson FG, Larsen BS, McEwen CN. Gas Chromatography and Mass Spectrometry, A Practical Guide; Academic Press: San Diego, 1996; Chapter 9..

3. Molnár-Perl I, Katona ZF. 2000. GC-MS of amino acids as their trimethylsilyl/t-butyldimethylsilyl Derivatives: In model solutions III. Chromatographia. 51(1):S228-S236. https://doi.org/10.1007/bf02492811