層析純化的樣品製備

用於色譜純化的樣品應是清澈且無微粒物質的。

樣品提取程序以及緩衝劑、添加劑和洗滌劑的選擇在很大程度上取決於材料的來源、目標分子的穩定性、將採用的色譜技術以及產品的預期用途。這些主題在《蛋白質純化手冊》( Protein Purification Handbook  中有概括性的論述，而在《重組蛋白質手冊》( Recombinant Protein Handbook  中則根據目標分子做了更明確的說明。重組蛋白質手冊、 蛋白質擴增和簡單純化，以及 抗體純化手冊，可從 Cytiva 獲得。

樣品穩定性

在大多數情況下，純化後需要保留生物活性。在跟進純化進度時，保留目標分子的活性也是一項優勢，因為目標分子的檢測通常有賴於其生物活性。樣品成分的變性通常會導致沉澱或非特異性吸附的增強，這兩種情況都會損害色譜柱的功能。

蛋白通常包含高度的三级结构，通过范德华力、离子和疏水相互作用以及氢键保持在一起。任何能破壞這些作用力穩定性的條件都可能導致變性和/或沉澱。相較之下，縮氨酸含有較低程度的三次結構。它們的原生狀態是以次級結構為主，主要靠氫鍵來穩定。因此，與蛋白質相比，肽可容忍的條件範圍更廣。原生結構的基本差異也反映在蛋白質不易變性，而多肽則經常自動變性。

建議您在開始制定純化方案之前先進行穩定性測試。以下清單可作為此類測試的基礎：

• 在 pH 2 和 pH 9 之間，以一個 pH 單位為單位測試 pH 的穩定性。
• 以 0-2 M NaCl 和 0-2 M (NH4)2SO4 為單位，以 0.5 M 為單位測試鹽的穩定性。
• 測試對乙腈和甲醇的穩定性，在 0% 和 50% 之間以 10% 為單位。
• 測試對溫度的穩定性，在 4 °C 到 40 °C 之間以 10 °C 為單位。將每個樣品離心，測量上清液的活性和 280 nm 處的紫外吸光度。

樣品澄清

離心和過濾是標準的實驗室樣品澄清技術，在處理小樣品時經常使用。

離心和過濾是標準的實驗室樣品澄清技術，在處理小樣品時經常使用。

强烈建议在色谱纯化前立即离心和过滤任何样品。

离心

离心可去除脂质和颗粒物质，如细胞碎片。如果離心後的樣品仍不清晰，可使用濾紙或 5 μm 過濾器作為第一步過濾器，再使用以下其中一種過濾器作為第二步過濾器。

• 對於小量樣品或吸附在過濾器上的蛋白質，可在 10 000 ×g 下離心 15 分鐘。
• 對於細胞裂解液，可在 40 000-50 000 ×g 離心 30 分鐘。
• 離心後，可將血清樣品用玻璃棉過濾，以去除殘留的脂質。

過濾

過濾可去除微粒物質。

對於層析前的樣品準備，請選擇與層析介質珠子大小相關的過濾器孔徑。

表 26 根據珠子大小選擇過濾孔徑。

過濾器的標稱孔徑	層析介質的粒徑
1 μm	90μm以上
0.45 μm	30或34 μm
0.22 μm	3、10、15 μm 或需要額外乾淨的樣品或無菌過濾時

在試運行中檢查目標蛋白質的回收率。某些蛋白可能會非特異性地吸附在濾網表面。

脫鹽

脫鹽柱適用於任何樣品容量，在將樣品轉移到正確的緩衝液條件下的同時，可在單一步驟中快速去除低分子量雜質。仍建議在脫鹽前對樣品進行離心和/或過濾。

在實驗室規模下，當過濾或離心後的樣品相當乾淨時，可以避免緩衝液交換和脫鹽步驟。對於親和層析或疏水作用層析，可能只需調整樣品的 pH 值即可，必要時可稀釋以降低溶液的離子強度。

• 快速處理少量或大量樣品。如果需要，在純化步驟之前和/或之間使用（請記住，每個額外的步驟都會降低產率，而且脫鹽會同時稀釋樣品）。
• 從分子量為 M_r > 5000 的蛋白質中去除鹽分。
• 如果需要揮發性緩衝液，請使用 100 mM 乙酸銨或 100 mM 碳酸氫銨。

特定的樣品製備步驟

如果已知粗樣品含有可能在色譜柱上堆積的雜質（如脂質、脂蛋白或酚紅），或者某些總雜質（如大量蛋白質）應在任何色譜步驟前去除，則可能需要特定的樣品製備步驟。

分離沉澱

分離沉澱常用於實驗室規模，以去除小量樣品中的總雜質，偶爾也用於小規模的商業生產。沉澱技術利用溶解度差異的原理分離餾分。由於蛋白質種類的疏水程度不同，鹽濃度的增加會增強蛋白質之間的疏水作用，造成沉澱。如 圖 86所示，分離沉澱可以三種不同的方式去除粗雜質。

圖 86. 使用降水的三種方法。

表 27 中檢視了沉澱劑的範例。更詳細地說明了使用硫酸銨的最常見沉澱方法。

樣品類型	如下所述。	> 1 mg/mL 蛋白質，尤其是免疫球蛋白。	穩定蛋白質，不變性；上清液可直接進入 HIC。 有助於降低脂質含量。
加入 0.04 mL 10%硫酸葡聚糖和 1 mL 1 M CaCl2，混和 15 分鐘，離心 10 000 ×g，棄去沉澱物、	沉澱脂蛋白。
加入 3% (w/v)，攪拌 4 小時，離心 17 000 ×g，棄去沉澱物。	具有高水平脂蛋白的樣品，例如：腹水、	硫酸葡聚糖的替代方法。
聚乙二醇 (PEG，Mr ”。gt; 4000）	血漿蛋白質。	不變性，上清液直接進入 IEX 或 AC，可能難以完全去除。穩定蛋白質。
0°C時高達80%vol/。	高達 80%vol/ 於 0°C 離心，在 Eppendorf™ 離心機中全速離心後收集沉澱物。
0.1% w/v		沉澱聚集的核蛋白。
1% w/v<		沉澱聚集的核蛋白。
1% w/v		核酸沉澱。
X/15) g 其中 X = 样品体积。	沉澱血清或腹水中的大部分蛋白質，使免疫球蛋白留在溶液中。

詳細資料取自：Scopes R.K.、Protein Purification, Principles and Practice, Springer, (1994), J.C. Janson and L. Rydén, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd ed. Wiley Inc, (1998).

個人通訊。

硫酸銨沉澱

硫酸銨可能會破壞某些蛋白質。加入結晶硫酸銨時要小心：局部濃度過高可能會使沉澱物受到不需要的蛋白質污染。

對於常規、可重複的純化，應避免使用硫酸銨沉澱，而改用層析法。

一般而言，蛋白質濃度低於 1 mg/mL 時，沉澱很少有效。

沉澱所需溶液：

   飽和硫酸銨溶液（在 100 mL 蒸餾水中加入 100 g 硫酸銨，攪拌溶解）。

   1 M Tris-HCl，pH 8.0。

    Buffer for first purification step

1. 過濾（0.45 μm）或離心樣品（10 000 ×g at 4 °C）。
2. 在 10 份样品体积中加入 1 份 1 M Tris-HCl，pH 8.0，以保持 pH 值。
3. 轻轻搅拌。逐滴加入硫酸銨溶液。添加至 50% 飽和度*。攪拌 1 小時。
4. 10 000 ×g 離心 20 分鐘。
5. 去除上清液。用相同濃度的硫酸銨溶液（即不會重新溶解沉澱蛋白或導致進一步沉澱的溶液）重懸洗滌沉澱物兩次。再次離心。
6. 將沉澱物溶解在下一步使用的小容量緩衝液中。
7. 在使用 Sephadex™ G-25 的澄清/緩衝液交換步驟中，使用脫鹽柱去除硫酸銨（見第 136 頁）。

*飽和度百分比可以調整，以沉澱目標分子或沉澱雜質。

達到特定飽和度所需的硫酸銨數量因溫度而異。 表 28 顯示 20 °C 時所需的硫酸銨數量。

表 28 在 20 °C 達到指定飽和度所需的硫酸銨數量

Final percent saturation to be obtained+A1：R23
	20	25	30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80	85	90	95	100
0	113	144	176	208	242	277	314	351	390	430	472	516	561	608	657	708	761
5	85	115	146	179	212	246	282	319	358	397	439	481	526	572	621	671	723
10	57	86	117	149	182	216	251	287	325	364	405	447	491	537	584	634	685
15	28	58	88	119	151	185	219	255	293	331	371	413	456	501	548	596	647
20	0	29	59	89	121	154	188	223	260	298	337	378	421	465	511	559	609
25		0	29	60	91	123	157	191	228	265	304	344	386	429	475	522	571
30			0	30	61	92	125	160	195	232	270	309	351	393	438	485	533
35				0	30	62	94	128	163	199	236	275	316	358	402	447	495
40					0	31	63	96	130	166	202	241	281	322	365	410	457
45						0	31	64	98	132	169	206	245	286	329	373	419
50							0	32	65	99	135	172	210	250	292	335	381
55								0	33	66	101	138	175	215	256	298	343
60									0	33	67	103	140	179	219	261	305
65										0	34	69	105	143	183	224	267
70											0	34	70	107	146	186	228
75												0	35	72	110	149	190
80													0	36	73	112	152
85														0	37	75	114
90															0	37	76
95																0	38

蛋白沉澱物的再溶解

許多蛋白很容易在下一層析步驟使用的少量緩衝液中再溶解。然而，對於溶解度較低的蛋白質，可能需要使用變性劑。具體條件取決於特定蛋白質。這些變性劑必須經常移除，以讓蛋白質完全重新折疊，並最大限度地回收質量和活性。表 29舉例說明常用的變性劑。

去除/注釋
2 M-8 M	使用 Sephadex G-25 去除。
3 M-6 M	使用 Sephadex G-25 或在 IEX 期間移除。
Triton X-100	2%	使用 Sephadex G-25 或在 IEX 期間移除。
Sarcosyl	1.5%	使用 Sephadex G-25 或在 IEX 期間移除。
2%	使用 Sephadex G-25 或在 IEX 期間移除。
0.1%-0.5%	在第一層析步驟中交換為非離子洗滌劑，避免使用陰離子交換層析。
> pH 9，NaOH	在層析過程中可能需要調整 pH 值以保持溶解度。

詳細資料取自： Scopes R.K.、，Springer，(1994)，J.C. Janson and L. Rydén，Protein Purification，

Principles，High Resolution Methods and Applications，2nd ed. Wiley Inc，(1998)及其他資料來源。

緩衝區交換與脫鹽

文獻中經常提到透析是一種去除鹽或其他小分子並交換樣品緩衝區成分的技術。然而，透析通常是一種非常緩慢的技術，需要大量的緩衝液。在處理過程中，或由於蛋白質分解或與透析膜的非特異性結合，有可能造成物質流失。更簡單快速的技術是使用含有 Sephadex G-25 的脫鹽柱，在高分子量和低分子量物質之間進行組別分離。

在一個快速的單步驟中，樣品被脫鹽，轉移到新的緩衝液中，低分子量物質被移除。

脫鹽柱不僅可用於去除低分子量污染物（如鹽），還可用於不同色譜步驟前後的緩衝液交換，以及快速去除試劑以終止反應。

可處理高達脫鹽柱總容量 30% 的樣品。使用普通水性緩衝液時，只要蛋白質濃度不超過 70 mg/mL，樣品濃度不會影響分離效果。樣品應完全溶解。離心或過濾以去除顆粒物質。

對於小量樣品，可以用要用於色譜純化的起始緩衝液稀釋樣品，但仍必須去除細胞碎片和顆粒物質。

為了防止可能發生的離子相互作用，建議在脫鹽過程中和最終的樣品緩衝液中使用低鹽濃度（25 mM NaCl）。

如果需要避免 NaCl 的存在，可以使用 100 mM 醋酸銨或 100 mM 碳酸氫銨等揮發性緩衝液。

圖 87. 小鼠血漿 (10 mL) 在 HiPrep™ 26/10 除鹽器上進行緩衝液交換。

對於實驗室規模的操作，表 30顯示了預包裝、即用型脫鹽和緩衝物交換色譜柱的選擇指南。

色譜柱	樣品容量	樣品洗提容量
MicroSpin™ G-25	0.1-0.15 mL	0.1-0.15 mL
PD-10 (重力柱)	1.5-2.5 mL	2.5-3.5 mL
HiTrap™ 除鹽 5 mL	0.25-1.5 mL	1.0-2.0 mL
HiPrep™ 26/10 除鹽	2.5-15 mL	7.5-20 mL

要脫鹽更大的樣品容量：

• 最多串聯 5 支 HiTrap™ 5 mL 脫鹽柱，以增加樣品容量，例如，2 支柱：樣品容量 3 mL，5 支柱：樣品容量 7.5 mL。
• 最多串联 4 支 HiPrep™ 26/10 脱盐柱，以增加样品体积容量，例如，2 支柱：样品体积 30 mL，4 支柱：样品体积 60 mL。即使串聯 4 支色谱柱，在室溫下，在水性緩衝液中，也可在 20 至 30 分鐘內完成樣品處理。

每支色譜柱隨附說明書。每個樣品的脫鹽和緩衝液交換時間少於 5 分鐘，大多數蛋白質的回收率高於 95%。

替代方案 1：使用注射器用 HiTrap™ 人工脫鹽 5 mL

1. 在注射器中注入緩衝液。取出止塞。為避免將空氣引入色譜柱，將色譜柱"滴對滴"連接至注射器（通過提供的轉接器）。
2. 移除色譜柱出口處的卡扣端。
3. 用25 mL緩衝液以5 mL/min的速度沖洗色譜柱，完全去除20%乙醇（作為儲存緩衝液提供）。如果柱中殘留空氣，請使用脫氣緩衝液清洗，直到空氣消失。
4. 使用 2-5 mL 注射器，以 1-10 mL/min 的流速上樣。
5. 如果样品体积小于 1.5 mL，则换成缓冲液继续进样，直到总共洗脱 1.5 mL。
6. 用從表 31 中選擇的適當容量稀釋蛋白質。

收集所示容量的脫鹽蛋白質。

注意：使用 HiTrap™ 5 mL 色譜柱時，5 mL/min 約相當於 120 滴/分。也可以使用簡單的蠕動泵來施加樣品和緩衝液。

建議的最大樣品容量為 1.5 mL。請參閱表 31，瞭解減少施加到色谱柱上的樣品容量的效果。

也可使用簡單的蠕動泵施加樣品和緩衝液。

樣品載量 mL	加入緩衝液 mL	靜置並收集 mL<	產率%	剩餘鹽分%	稀釋係數
0.25	1.25	1.0	>95	0.0	4.0
0.50	1.0	1.5	>95	<0.1	3.0
1.00	0.5	2.0	>95	<0.2	2.0
1.50	0	2.0	>95	<0.2	1.3

替代方案 2：使用 ÄKTAprime Plus 進行簡單的脫鈣處理

ÄKTAprime™ Plus 包含用於個別 HiTrap™ 5 mL 脫鈣柱和 HiPrep™ 26/10 脫鈣柱的預編程模板。

Buffer Preparation

準備至少500 mL所需的緩衝液。

1. 按照ÄKTAprime Plus提示卡上提供的說明，連接色譜柱並使用緩衝液加載系統。
2. 選擇應用模板。
3. 啟動方法。
4. 輸入樣品容量並按OK。

圖88顯示ÄKTAprime Plus的典型結果。紫外線（蛋白質）和電導率（鹽）痕跡可將脫鹽馏分匯集起來。

圖 88. 在 ÄKTAprime Plus 上對(Histidine)6-標記融合蛋白進行脫鹽處理。

去除脂蛋白

脂蛋白和其他脂質物質會快速堵塞層析柱，建議在開始純化之前先去除它們。建議使用沉澱劑，如硫酸葡聚糖和聚乙烯吡咯烷（在分離沉澱中描述），從腹水等樣本中去除高含量的脂蛋白。

離心樣本，以避免目標分子與過濾器非特異性結合的風險。

血清等樣品可以用玻璃棉過濾，以去除殘留的脂質。

去除酚紅

酚紅在實驗室規模中經常用作細胞培養的 pH 指示劑。酚紅雖然不會直接干擾純化，但可能會與某些純化媒體結合，因此應儘早移除以避免污染風險。

使用脫鹽柱同時去除酚紅（低分子量分子），並將樣品轉移到正確的緩衝條件下進一步純化，如緩衝液交換和脫鹽中所述。

去除低分子量污染物

如果樣品中含有大量低分子量污染物，請在第一個色譜純化步驟前使用脫鹽柱，如緩衝液交換和脫鹽中所述。