使用 Titan C18 色譜柱進行水溶性維生素的 HPLC 分析

引言

維生素是重要的化合物，也是正常新陳代謝所必需的。它們天然存在於許多食物中，也經常被添加到加工食品中。水溶性維他命包括硫胺素 (B1)、核黃素 (B₂)、菸鹼酸 (B₃)、吡哆醇 (B₆))、泛酸 (B₅)、生物素 (B₇)、葉酸 (B₉) 和氰鈷胺 (B₁₂)。維生素的定性與定量分析是一項常規但具挑戰性的工作，因為維生素相對不穩定，且會受到熱、光、空氣和其他食物成分等多種因素的影響。

實驗

使用 Agilent 1290 UHPLC 系統進行分離。UV 檢測波長設定為 220 nm。本研究使用的色譜柱為 Titan C18，5 cm x 2.1 mm I.D.，填料為單分散 1.9 µm 顆粒。B 族維生素非常親水，因此在反相條件下使用低濃度甲醇和酸性流動相進行梯度洗脫。

水溶性維生素從我們這裡獲得。

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結果與討論

使用低濃度的乙腈或甲醇水溶液，B 族維生素可以從反相柱中洗脫出來。在pH值為3時，少數化合物（硫胺、吡哆醇、菸鹼醯胺）在C18 Titan色譜柱上的保留力非常弱，只需要0.5%的甲醇即可洗脫。生物素、氰鈷胺和核黃素等維生素的疏水性較強，因此保留效果較好。梯度洗脱需要将甲醇浓度提高到 30%。Titan C18色譜柱對所有9種維生素都有良好的保留效果，所有維生素峰的基線分離都很容易實現（圖1）。所有維生素均在 2.5 分鐘內洗脫，且峰形良好。雖然Titan C18色譜柱含有2微米以下的微粒，但在使用甲醇水溶液流動相時，總背壓並沒有過大；眾所周知，甲醇水溶液流動相的可壓縮性較低，導致背壓高於使用乙腈水溶液流動相時的背壓。在分離過程中，Titan 色譜柱背壓的峰值為 550 bar。

所開發的 HPLC 方法應用於分析維生素水中的 B 族維生素。在注入 HPLC 之前，飲料已經過濾，不需要稀釋。通過與標準混合物進行比較，確定了四種B族維生素的峰值（圖2）。

除泛酸鈣、核黃素和生物素為 250 µg/mL 外，其他標準溶液均為 100 µg/mL。
條件：色譜柱： Titan C18, 5 cm x 2.1mm, 1.9 µm (Product No. 577122-U); 流动相： [A] 20 mM磷酸二氢钾，pH 3.0；[B] 甲醇； 梯度： 0.5% B 0.5 min，1.3 min 升至 30% B，30% B 保持 1 min，0.5% B 再平衡 0.8 min; flow rate: 0.5 mL/min (backpressure not more than 550 bar); detector: UV, 220 nm; injection: 0.5 µL

條件：色譜柱： Titan C18, 5 cm x 2.1 mm, I.D.、1.9 µm (577122-U); 流动相： [A] 20 mM 磷酸鉀，pH 3.0；[B] 甲醇； 梯度： 0.5% B 0.5 min，1.3 min 升至 30% B，30% B 保持 1 min，0.5% B 再平衡 0.8 min； ；流速： ；0.5 mL/min (backpressure not more than 550 bar); detector: UV, 220 nm; injection: 0.5 µL

結論

使用 Titan C18 色譜柱進行分析，在 2.5 分鐘內對 9 種水溶性維生素的混合物進行了極佳的解析。使用甲醇水溶液梯度和酸性pH值的流动相时，极性化合物在C18柱上的保留是充分的。將該方法應用於維生素水的分析，並確定了添加到水中的四種B族維生素。