Resolução de problemas de contaminação de cultura celular

Visão geral
Tipos de contaminação
Causas comuns e prevenção de contaminantes
   Contaminação microbiana (bactérias, fungos, leveduras)
   Micoplasma
   Contaminação viral
   Contaminação química
Dicas e técnicas gerais
   Trabalho no gabinete de segurança biológica
   Pipetagem e prevenção de aerossóis
   Desinfecção
   Como realizar o monitoramento de rotina de células saudáveis

Contaminação de culturas: Visão geral

Embora a “contaminação da cultura celular” normalmente evoque pensamentos de bactérias entre as células e meios turvos, os invasores indesejados no frasco de cultura podem assumir muitas formas. Os contaminantes virais e químicos também podem ter consequências consideráveis para a saúde da cultura celular, e garantir que as linhas celulares não sofram contaminação cruzada é fundamental para a reprodutibilidade dos resultados.

Quão difundida é a contaminação celular? Com base em estudos da FDA, ATCC e outros, estima-se que de 5 a 30% de todas as culturas celulares atuais estejam contaminadas apenas com espécies de micoplasma. A incidência de contaminação viral de linhas celulares comuns excedeu 25% em um estudo⁵, e os vírus não citopáticos têm ainda mais probabilidade de escapar da detecção do que o micoplasma, pois a saúde da cultura pode não fornecer pistas sobre sua presença.

Figura 1. Contaminação celular

A chave para o controle de um contaminante específico às vezes está relacionada à facilidade com que ele é detectado. Os contaminantes bacterianos, fúngicos e de levedura geralmente são visíveis a olho nu e podem matar rapidamente as células em cultura, mas a morfologia sutil pode dificultar a identificação de intrusos microbianos significativos, como o micoplasma. Em comparação, os vírus não podem ser detectados pela microscopia de luz convencional e, portanto, sua descoberta é muitas vezes motivada por observações de desprendimento inexplicável ou outros sinais de saúde celular ruim ou até mesmo de morte celular.

Uma das preocupações mais importantes enfrentadas pela comunidade de biologia nos últimos anos é a contaminação ou até mesmo a identificação incorreta de linhas celulares de pesquisa. Para saber mais sobre esse importante tópico, clique aqui para entender as causas e a prevalência de linhas celulares contaminadas e como avaliar a integridade da identidade da linha celular.

Tipos de contaminação de culturas

Bactérias, fungos e leveduras:
Contaminantes microbianos

A contaminação por bactérias, fungos (inclusive bolores) e leveduras geralmente é visível a olho nu como turbidez de início rápido e mudança de cor do meio de cultura (desde que o meio seja suplementado com vermelho de fenol, o indicador de pH não tóxico mais comum). A microscopia de luz padrão também revelará células bacterianas e estruturas fúngicas, portanto, a observação microscópica diária das culturas garantirá a detecção precoce da contaminação microbiana e permitirá que a ação apropriada seja tomada assim que os primeiros sinais se tornarem aparentes. Em particular, a remoção imediata de culturas contaminadas é necessária para proteger as culturas vizinhas, bem como o ambiente estéril de cultura de tecidos, incluindo incubadoras de cultura, banhos e o gabinete de biossegurança. Além disso, testes específicos para bactérias e fungos devem ser usados como parte de um procedimento de triagem de controle de qualidade regular e de rotina.

Causas comuns e prevenção de contaminação microbiana

Raiz / Causa	Prevenção
Técnica:
Manipulações, pipetagem, dispensação
Superfícies e equipamentos não esterilizados	Limpe a área de trabalho de itens que não estejam sendo usados imediatamente.
Vazamento nos gargalos e na parte externa dos frascos e na superfície de trabalho	Limpe regularmente com álcool 70%. Não derrame líquidos. Distribua por pipeta, dispensador automático ou dispositivo de transferência. Se o vazamento for inevitável: (1) faça isso em um único movimento suave, (2) descarte a garrafa da qual está derramando.
Tocar ou segurar a pipeta muito perto da ponta, tocar os gargalos das garrafas, dentro das tampas de rosca	Segure as pipetas acima das graduações. Manuseie pipetas estéreis com a luva de proteção.
Respingos do béquer de resíduos	Descarte os resíduos em um béquer com um funil ou use vácuo para retirar os resíduos sempre que possível.
Poeira sedimentar ou partículas de pele depositadas na cultura ou no frasco; mãos ou aparelhos mantidos sobre uma placa, frasco ou prato aberto	Nunca passe as mãos, trabalhe sobre recipientes abertos Não trabalhe sobre (fluxo laminar vertical e bancada aberta) ou atrás e sobre (capela de fluxo laminar horizontal) um frasco ou prato aberto.
Cabelo, mãos, hálito e roupas do operador
Poeira da pele, do cabelo ou da roupa que cai ou é soprada na cultura	Lave bem as mãos e use um jaleco que não solte fiapos. Use um jaleco de laboratório reservado exclusivamente para a sala de cultura. Prenda os cabelos compridos para trás ou use uma touca. Fique de costas para o trabalho quando for necessário falar.
Aerossóis provenientes de conversas, tosse, espirros, etc.	Evite trabalhar com um resfriado ou use uma máscara.
Materiais e reagentes
Soluções
Reagentes e meios não estéreis	Filtre ou autoclave as soluções antes de usá-las.
Procedimentos de esterilização inadequados	Monitore o desempenho da autoclave com um termômetro de registro ou indicador de esterilidade. Faça testes ou culturas de soluções esterilizadas se houver suspeita de contaminação.
Controle de qualidade deficiente no fornecedor comercial	Obtenha meios, tampões e soros somente de fornecedores confiáveis que certificam a qualidade e a origem.
Vidros e tampas de rosca
Poeira e esporos do armazenamento	Proteja as tampas com papel alumínio. Limpe os frascos com álcool 70% antes de levá-los para a capela.
Instrumentos, pipetas
Esterilidade não confiável	Use suprimentos descartáveis, estéreis e embalados individualmente de um fornecedor de boa reputação. Esterilize os itens reutilizáveis com calor seco antes de usá-los.
Contato com uma superfície não estéril ou com algum outro material	Não segure nenhuma parte de um instrumento ou pipeta que possa entrar em um recipiente para cultura.
Frascos para cultura e frascos de meio em uso
Poeira e esporos da incubadora ou do refrigerador	Use tampas de rosca em vez de rolhas. Limpe os frascos com um cotonete antes de colocá-los na capela. Use contenção secundária para as placas.
Condições de armazenamento ou incubação sujas	Cubra as tampas e os gargalos dos frascos com papel alumínio durante o armazenamento ou a incubação. Limpe os depósitos e as incubadoras regularmente.
Meios sob a tampa e se espalhando para a parte externa do frasco	Descarte todas as garrafas que apresentem derramamento na parte externa do gargalo. Não derramar.
Equipamentos e instalações
Ar ambiente
Correntes de ar, redemoinhos, turbulência, poeira, aerossóis	Dedique um espaço apropriado para a cultura de tecidos/células Reduza o tráfego e as atividades estranhas. Limpe o piso e as superfícies de trabalho regularmente.
Cabines de biossegurança de fluxo laminar
Filtro perfurado	Verifique regularmente se há furos e vazamentos nos filtros.
Filtro sujo	Verifique a queda de pressão no filtro.
Vazamentos, especialmente em fendas ou abaixo de uma superfície de trabalho	Desinfete regularmente ao redor e abaixo da superfície de trabalho. Deixe o álcool escorrer para as fendas.
Incubadoras umidificadas com CO2
Crescimento de fungos e bactérias nas paredes e prateleiras em uma atmosfera úmida	Limpe regularmente de acordo com as especificações do fabricante com a desinfecção adequada.
Esporos, etc., transportados por circulação de ar forçado	Coloque os pratos abertos em caixas plásticas com tampas bem ajustadas (mas não feche as tampas).
Banheiras e outros equipamentos
Contaminação em banhos-maria usados para aquecer soluções	Limpe e desinfete o banho-maria regularmente; limpe bem os recipientes com álcool 70% antes de transferi-los para a cabine de biossegurança para uso quando estiverem secos.
Poeira em cilindros de gás, bombas, etc.	Considere o uso de um banho de aquecimento que não seja à base de água (esferas). Limpe com álcool 70% antes de entrar na sala de cultura.
Importação de materiais biológicos
Linhagens celulares recebidas
Suspeita de contaminação na fonte ou durante o transporte	Manuseie essas linhas celulares isoladamente, de preferência em quarentena. Verifique se há contaminação cultivando uma cultura por duas semanas sem antibióticos. Inspecione a contaminação visualmente, por microscopia de contraste de fase e coloração Hoechst/DAPI para micoplasma.

Micoplasma

Os micoplasmas são um gênero de bactérias que não possuem paredes celulares e, portanto, não são afetados por antibióticos que limitam o crescimento bacteriano ao inibir a formação da parede celular. Sua morfologia flexível e o tamanho das células na faixa de 0,15 a 0,3 µm significam que elas podem escapar das abordagens padrão de filtração de cultura celular, que geralmente usam filtros com poros de 0,22 µm. Diferentemente da maioria dos outros contaminantes bacterianos, os micoplasmas não são aparentes em uma inspeção casual e são difíceis de detectar por microscopia de luz devido à sua morfologia e tamanho notavelmente pequeno. O título de micoplasma em cultura pode atingir 10⁸ organismos/ml sem causar turbidez no meio. Geralmente não matam as células de mamíferos que infectam, mas afetam significativamente as culturas celulares alterando o metabolismo celular, causando aberrações cromossômicas, retardando o crescimento celular e interferindo na fixação das células. Em resumo, é provável que eles influenciem drasticamente os resultados da maioria dos experimentos realizados com as linhas celulares afetadas.

Figura 2. Agentes de detecção de DNA, tais como DAPI ou Hoechst, revelam a presença de micoplasma em culturas contaminadas (direita) usando microscopia de fluorescência.

As variadas fontes de contaminação por micoplasma no laboratório podem representar um desafio. Como certas espécies de micoplasma são encontradas na pele humana, elas podem ser introduzidas por meio de uma técnica asséptica inadequada, além da introdução por meio de suplementos contaminados, como o soro bovino fetal.  Os micoplasmas são altamente transmissíveis entre culturas celulares contaminadas vizinhas. A filtração de meios e tampões com membranas com poros de 0,1 µm ou menos é necessária para o tratamento de micoplasma, pois os dispositivos de filtração de meios padrão com poros de 0,22 ou 0,45 µm não conseguirão excluir esses pequenos organismos.

Prevenção, detecção e eliminação da contaminação por micoplasma

Quando o micoplasma contamina uma cultura, ele pode se espalhar rapidamente para outras áreas do laboratório. A adesão rigorosa a boas práticas laboratoriais é fundamental, e testes rotineiros para micoplasma são altamente recomendados para o controle bem-sucedido de contaminação por micoplasma. Os três métodos mais populares de detecção incluem cultura de micoplasma, método de coloração de DNA e detecção baseada em PCR. Oferecemos uma variedade de soluções para a detecção e eliminação de micoplasma. É fundamental estabelecer uma rotina para a triagem de micoplasma nas culturas, mesmo que você não suspeite da presença desse contaminante no laboratório.

Prevenção da contaminação microbiana:  os antibióticos são a resposta? Um deles na cultura de tecidos é o uso rotineiro de antibióticos, isoladamente ou em coquetéis com antifúngicos. Assim como ocorre com os antibióticos terapêuticos prescritos pelos médicos, o uso contínuo ou inadequado de antibióticos pode levar ao desenvolvimento de cepas resistentes que são difíceis de erradicar e podem exigir o uso de antibióticos de gerações posteriores que podem ser tóxicos para as culturas celulares. Estudos recentes levantaram preocupações adicionais sobre o potencial de alteração da expressão gênica em culturas celulares na presença de antibióticos.

Contaminação viral

Os vírus estão entre os contaminantes de cultura celular mais difíceis de detectar em cultura, exigindo métodos de microscopia que seriam impraticáveis para a maioria dos laboratórios de pesquisa. Eles podem se originar da fonte celular do paciente ou do animal hospedeiro, e várias linhas celulares de importância biotecnológica demonstraram conter retrovírus endógenos.  Mais frequentemente, as células são infectadas por vírus presentes em materiais derivados de animais usados para cultivá-las. O tamanho pequeno dos vírus torna muito difícil removê-los de meios, soros e outras soluções de origem biológica. Entretanto, como a maioria dos vírus é restrita ao hospedeiro e até mesmo ao tecido, isso pode limitar sua capacidade de infecção entre espécies ou entre tecidos. Embora os vírus possam ser mais comuns em culturas celulares do que muitos pesquisadores imaginam, eles podem ou não representar um fator de confusão significativo para a cultura celular se não induzirem efeitos citopáticos ou outros efeitos adversos nas células.

Além do potencial de causar impacto nas células cultivadas, uma grande preocupação com o uso de culturas celulares infectadas por vírus é o possível risco à saúde que elas representam para o pessoal do laboratório. Precauções especiais de segurança devem sempre ser usadas ao trabalhar com tecidos ou células de humanos ou outros primatas para evitar a possível transmissão de infecção viral (HIV, hepatite B, Epstein-Barr, vírus do herpes B símio, entre outros) das culturas celulares para o pessoal do laboratório. Os responsáveis pela segurança ambiental da instituição devem ser consultados com relação aos procedimentos para trabalhar com tecidos, culturas ou vírus potencialmente perigosos. Para saber mais sobre a avaliação de riscos para a equipe de laboratório que trabalha com cultura celular, clique aqui

Práticas recomendadas para reduzir a incidência de contaminação viral de culturas celulares:
*Limitar o número de fontes biológicas (fornecedores, animais) das quais as células são extraídas.
*Selecionar animais/células que sejam menos suscetíveis a vírus.
*Obter células de repositórios que realizam testes de vírus e fornecem certificação de linhas celulares livres de vírus.

Contaminação química

Qualquer contaminante não vivo da cultura celular é frequentemente classificado como um contaminante “químico”.  Esses contaminantes podem se originar de reagentes ou da água usada em meios ou tampões, ou de equipamentos e suprimentos.  Alguns exemplos incluem radicais livres, íons metálicos, resíduos de desinfetantes/detergentes ou até mesmo endotoxinas que persistem depois que os contaminantes bacterianos anteriores não estão mais presentes.

Dicas para evitar a contaminação química:
*Sempre use água de qualidade laboratorial para preparar tampões e soluções e suspender novamente reagentes liofilizados.
*Qualquer material de laboratório reutilizável deve ser enxaguado exaustivamente e seco ao ar - a autoclavagem não terá efeito sobre os resíduos de detergente.
*Adquira meios, suplementos e soro (FBS, FCS) exclusivamente de fornecedores que ofereçam certificação de teste de endotoxina.

Dicas e técnicas gerais para prevenir e eliminar a contaminação

Trabalho no gabinete de segurança biológica

Ao trabalhar dentro do gabinete de biossegurança, é útil lembrar que o fluxo de ar é fundamental para ajudar a manter um ambiente estéril. As aberturas de ventilação traseira e frontal devem estar sempre desobstruídas para obter um fluxo de ar eficaz. Antes de qualquer procedimento prático, o gabinete deve ser abastecido com todos os materiais necessários para minimizar o potencial de transferência de contaminantes para as mangas e mãos do operador.

Devem transcorrer pelo menos vinte minutos após o início do fluxo de ar antes de colocar os itens a serem usados no gabinete. Todos os itens que entram no gabinete devem ser borrifados primeiro com álcool estéril a 70% (v/v) e limpos com lenços sem fiapos para evitar que poeira e partículas entrem no gabinete. Certifique-se de que o fluxo de ar esteja bem estabelecido antes que qualquer tampa ou recipiente seja aberto, para permitir que o fluxo de ar limpe a área de trabalho de partículas que possam ter sido introduzidas.

Figura 3. Trabalhando em um gabinete de segurança

Pipetagem e prevenção de aerossóis

As pipetas plásticas descartáveis, também chamadas de pipetas sorológicas, disponíveis em capacidades de 1 a 100 ml, são ferramentas indispensáveis para a cultura celular. Elas devem ser embaladas individualmente para garantir a esterilidade. O cumprimento das orientações a seguir pode minimizar a contaminação e os riscos de segurança associados à pipetagem.

• Use auxiliares de pipeta automáticos, com cada auxiliar de pipeta restrito para uso em um único gabinete.  Para evitar contaminação, desmonte e desinfete regularmente as peças auxiliares da pipeta. Certifique-se de que os filtros auxiliares de pipeta sejam mantidos em um bom estoque e trocados regularmente.
• Use pipetas tampadas (tampadas na parte superior com algodão) sempre que possível, especialmente ao transferir o meio.  Evite puxar o líquido para dentro do plugue da pipeta. Se o plugue for acidentalmente molhado, troque imediatamente o filtro auxiliar de pipeta.
• Evite tocar completamente na pipeta sorológica desenrolando-a parcialmente, encaixando a extremidade no auxílio da pipeta e, em seguida, removendo a luva de papel.
• Para evitar a geração de aerossóis contaminantes, não crie bolhas no meio ou na pipeta.
  

Desinfecção

Os métodos projetados para a desinfecção/descontaminação de resíduos de cultura, superfícies de trabalho e equipamentos devem não apenas minimizar o risco de contaminação, mas também ser seguros para a equipe do laboratório. Sempre use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, como luvas e proteção para os olhos, ao usar formas concentradas de desinfetantes. As luvas selecionadas devem proteger contra a substância que está sendo manuseada. As tabelas dos fabricantes ajudarão a identificar as melhores luvas para uma determinada tarefa. Os principais desinfetantes são divididos em grupos, e seus méritos relativos podem ser resumidos da seguinte forma:

Hipoclorito de sódio ou alvejante

• Bom desinfetante para uso geral
• Ativo contra vírus
• Corrosivo contra metais - não deve ser usado em superfícies metálicas, como centrífugas
• Facilmente inativado por matéria orgânica e, portanto, deve ser renovado com frequência
• Use alvejante comercial para criar uma solução de 10% (v/v) no líquido residual ou para desinfecção de superfícies

Álcool (por exemplo, etanol, isopropanol)

• Concentrações eficazes: 70% para etanol, 60-70% para isopropanol
• Eficaz contra bactérias. O etanol é eficaz contra a maioria dos vírus, mas não contra os vírus não envelopados
• O isopropanol não é eficaz contra vírus
• Aldeídos são irritantes e seu uso deve ser limitado

Os desinfetantes à base de fenólicos devem ser evitados, pois não são apoiados como parte do programa de revisão da Diretriz de Produtos Biocidas da UE.

Como realizar o monitoramento de rotina de células saudáveis

O monitoramento de culturas celulares é uma parte importante da cultura celular cotidiana. Este tutorial ajudará a explicar os fundamentos do monitoramento de suas células, incluindo a aparência de uma cultura saudável, a confluência celular e as diferentes fases do crescimento da cultura celular. Este vídeo também mostrará indicadores comuns de contaminação bacteriana e por micoplasma.

Produtos relacionados

Meios de cultura	Soro bovino fetal	Detecção de micoplasma	Ponteiras	Frascos para cultura
Tripsina	Antibióticos	Corante de coloração de Hoechst	Álcool etílico	Pipetadores
Filtração estéril	Linhagens celulares autenticadas	Álcool isopropílico

Referências

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