使用Amicon^®Pro 离心过滤器进行蛋白质标记和纯化

市售蛋白标记试剂盒让研究人员可以灵活定制自己的免疫检测panel。然而，由于许多实验方案需要在抗体标记前后置换缓冲液，因此透析工作流程非常耗时，且在多次转移样品期间会造成蛋白质大量损失。

为去除蛋白质标记应用中未掺入的标记，离心装置是一种快速、方便、高回收率的凝胶过滤替代方案。

 

使用 Amicon^® Pro 离心过滤器进行小规模（25 μg – 200 μg）抗体标记

将标记步骤与一体化 Amicon^® Pro 系统纯化步骤相结合，可大幅提高抗体标记产量。Amicon^® Pro 纯化系统是一种灵活适配的离心装置，融合了亲和纯化与下游样品浓缩和缓冲液置换步骤。

Amicon^® Pro 系统的两大特质使其成为制备纯标记抗体的便捷设备：

1. 首先，此系统通过洗滤实现高效的缓冲液装置，并通过 15 分钟离心同时浓缩样品。
2. 其次，整个工作流程在单个系统内执行，减少了样品损失的可能。

有关 Amicon^® Pro 抗体标记应用的详情，请访问我们专门的抗体标记页面以及相关文献（阅读我们 2015 年在《Journal of Immunological Methods》上发表的论文）

关于使用 Amicon^® Pro 系统进行小规模抗体标记的实验方案概要，请见下文。

注意：除结合反应外，所有步骤均为离心法。除反向离心外，所有步骤都需要吊桶转子。

可选：使用 0.5 mL TBS-T 预湿设备。 1000 x g 离心 1 min。

1. 按如下方式将抗体溶液上样至 Amicon^® Pro 系统：
   对于稀释抗体 (< 1 mg/mL)，请将 Amicon^® Ultra 0.5 mL 过滤器 (10k MWCO) 装到 Amicon^® Pro 系统底座上。将抗体（最多 1 mL）上样至置换装置。4000 x g 离心 15 min。
2. 如需浓缩抗体 (≥ 1 mg/mL)，将样品（最多 100 µL）上样至 Amicon^® Ultra 0.5 mL 过滤器 (10k MWCO)。将过滤器装到 Amicon^® Pro 系统底座上。
3. 采用适当的反应缓冲液配制 1.5 mL 含染料的反应混合物。将混合物加入置换容器。
4. 4000 x g 离心 15 min。
5. 可选：如有必要，可将样品再室温孵育 30 分钟，以实现最优标记效率。更多详情请参阅我们的相关文献。
6. 将 1.5 mL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) ± 叠氮化钠加入置换容器。
7. 4000 x g 离心 15 min，置换缓冲液并浓缩。
8. 通过反向离心从 Amicon^® Ultra 0.5 过滤器中回收标记抗体。

抗体标记方案结果示例

表. 生物素化工作流程的时间和抗体回收率对比。

	传统 0.5 mL 离心洗滤装置	Amicon® Pro 纯化系统
样品纯化	120 min	15 min
生物素化反应	120 min	30 min
去除游离生物素，缓冲液置换，浓缩	45 min	15 min
实验方案总用时	3.5小时	1小时
抗体回收率	40%	72%

为比较传统离心洗滤法和 Amicon^® Pro 方法的标记抗体作用性能，将其检测能力与物种/物种 GAPDH 抗体检测对进行了对比。每次印迹使用相似量的一抗，两组生物素/SA 对均表现出与物种/物种抗体检测对相同乃至更高的（图 1）。

图 1.

抗GAPDH抗体使用 Amicon^® Pro 系统进行生物素化，用于在蛋白质印迹中成功检测 GAPDH。取 EGF 刺激的 A431 细胞裂解液 (0.25-4 µg) 等分试样通过 SDS-PAGE 分离，转印到 Immobilon^®-P 膜上，并使用各种间接检测对在 SNAP i.d.^® 2.0 系统中探测 β 微管蛋白。所有情况下使用相同数量的一抗（GAPDH 特异性）。