邻位连接技术（PLA）的工作原理
Duolink® 邻位连接检测
Duolink®邻位连接技术(PLA)是一种高特异性、高灵敏地原位检测内源性蛋白、蛋白修饰和蛋白互作的强大工具。该技术可轻松检测和定位未改造细胞和组织内单分子级别的蛋白靶标。一般先使用不同种属来源的两种一抗检测两个蛋白靶标（图1A）。接着用一对寡核苷酸标记的二抗（PLA探针/邻位探针）结合一抗（图1B）。再加入连接寡核苷酸，当一对邻位探针足够贴近时，连接寡核苷酸会与邻位探针对互补杂交，在连接酶的作用下形成封闭的环状DNA，作为滚环扩增(RCA)的模板（图1C）。接着DNA聚合酶以PLA探针为引物，以上述环状DNA为模板，通过RCA反应合成连环序列（图1D）。这使仍与PLA探针相连的序列信号扩大1000倍，方便进行信号定位。最后，用标记寡核苷酸与扩增子内的互补序列杂交（图1E），在荧光显微镜下表现为散点（PLA信号），实现可视化和定量分析（图1F）。Duolink® PLA技术可结合免疫荧光（即绿色、红色、远红或橙色检测）或免疫组化（即过氧化物酶催化反应）检测贴壁细胞、细胞离心涂片和组织切片。此外，Duolink® PLA技术还可结合流式细胞术检测血液或悬浮细胞，也可采用多孔板（例如，96或384孔板）搭配高内涵筛选成像仪进行高通量分析。Duolink® PLA的高特异性、灵敏度和多功能性使其成为信号通路分析、药物筛选、IC50 测定和靶标验证的理想选择。
图 1.Duolink® PLA 反应图示。((A)) 两种一抗蛋白特异性识别细胞中的目的蛋白。黄色和绿色小球代表单个蛋白的两个表位或两个互作蛋白的表位。(B)偶联寡核苷酸的二抗（PLA探针）结合一抗。(C)当两个PLA探针比较接近时，连接寡核苷酸杂交并连接PLA探针。(D)连接得到的封闭、环状DNA模板被DNA聚合酶扩增。(E)标记荧光染料的互补检测寡核苷酸与扩增子的重复序列杂交。(F)通过荧光显微镜检测到的PLA信号为离散光点，实现对蛋白或蛋白互作的胞内定位。
DUOLINK®邻位连接技术检测EGFR和HER2二聚化
表皮生长因子受体（EGFR，ErbB1，HER1）和人表皮受体2（HER2，ErbB2，Neu）的二聚化是一种众所周知的蛋白质相互作用（PPI）。EGFR和HER2是受体酪氨酸激酶ErbB家族的成员，在细胞分裂和死亡调控中起重要作用。影响其中任意一种蛋白质的表达或活性的突变与多种癌症的发生发展有关。当配体（如EGF）结合EGFR的胞外结构域时，EGFR受体激活并自磷酸化细胞质尾区。从而与ErbB家族其他成员形成同源(EGFR-EGFR)和异源（例如，EGFR-HER2）二聚体（图2）。二聚化及之后的磷酸化发生后，会募集一些衔接蛋白，进一步激活几个胞内信号通路，最终可调节基因转录，导致肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移和抗凋亡。
图 2.EGFR-HER2二聚化图示。表皮生长因子(EGF)等配体结合EGFR的胞外结构域，使其激活和自磷酸化。激活后，EGFR发生同源二聚化（未显示）或与HER2等其他ErbB家族成员发生异源二聚化。二聚化及后续的磷酸化进一步激活下游信号通路。图片来源：Lancet Oncol.16(15):e543-e554
DUOLINK® PLA对照试剂盒 – 成功的蛋白互作检测证明实验有效
人卵巢癌SKOV3细胞表达中等至高水平的EGFR与HER2蛋白。使用Duolink® PLA对照试剂盒–通过蛋白互作验证Duolink技术可原位检测EGF诱导的EGFR-HER2二聚化。每个试剂盒包括2个8孔腔室载玻片（内含EGF处理的预固定SKOV3细胞）、小鼠抗EGFR和兔抗HER2一抗。最佳抗体浓度已知，稀释建议可见产品说明书。细胞用1x PBS复溶后，加入0.2% Triton X-100（1x PBS溶液）室温透化10分钟，接着用Duolink® PLA封闭缓冲液37 °C封闭1小时。向一对复孔细胞加入两种一抗孵育。复孔设置技术阴性对照，包括分别加入一种一抗和不加任何一抗的孵育（图3）。洗涤后，按照Duolink® PLA荧光实验方案进行Duolink® PLA实验。所有孔加入Duolink®抗兔PLUS和抗小鼠MINUS PLA探针孵育，使用Duolink®原位检测试剂（远红）生成PLA信号。用Duolink®原位封片剂（含DAPI）封片并采用GE IN Cell Analyzer 2200成像仪采集图像。
图 3.Duolink® PLA对照试剂盒蛋白互作检测的玻片布局和样品位置。所有孔均包含EGF刺激的预固定SK-OV3细胞。成透化和封闭后，孔1和5加入兔抗EGFR和小鼠抗HER2一抗孵育，孔2和6只加入抗EGFR抗体孵育，孔3和7只加入抗HER2抗体孵育，孔4和8则仅加入抗体稀释剂孵育。
在37 °C下2小时（图4A-4D）或4°C过夜（图4E-4H)孵育一抗后的PLA结果相近，用户可灵活操作。同时加入抗EGFR和抗HER2两种一抗时，在EGF激活SK-OV3细胞中检测到强烈的PLA信号，代表丰富的EGFR:HER2复合体（图4A、4E）。虽然SK-OV3细胞经过一致的EGF处理，但各细胞的PLA信号/EGFR:HER2复合体数仍然不同这可能是因为SK-OV3细胞群内HER2差异表达（数据未显示）。。相对的，当仅使用一种抗体或同时剔除两种抗体时，几乎检测不到PLA信号（图4B-D、4F-H）。注意，假如一抗浓度过高，当只使用一种抗体时，PLA信号会增强和/或PLA阳性信号会重叠而无法准确定量（数据未显示）。因此，务必使用推荐的一抗浓度。这些数据共同表明使用Duolink® PLA对照试剂盒–蛋白互作可检测和定量EGF刺激SK-OV3细胞中的EGFR:HER2复合体。
图 4.Duolink® PLA检测EGF诱导的EGFR:HER2二聚化。在EGF处理的固定SK-OV3细胞玻片中加入小鼠抗EGFR和兔抗HER2抗体(A, E)、仅抗EGFR抗体(B, F)、仅抗HER2抗体(C, G)或只有抗体稀释剂(D, H) ，37 °C孵育2小时(A-D)或4 °C孵育过夜(E-H)。接着用抗兔PLUS和抗小鼠MINUS PLA探针进行Duolink® PLA实验。使用DAPI（蓝色细胞核）与Cy5（红色PLA信号）滤光片每孔随机采集10张20倍放大图像。图像来自5个独立实验的代表性结果。
DUOLINK® PLA邻位产品的蛋白检测形式
Duolink® PLA产品分为荧光类和明场类。Duolink® PLA荧光试剂现可用于显微镜和流式细胞术两种检测形式。
荧光检测
荧光显微镜检测是Duolink® PLA实验最常用的应用形式。Duolink® PLA荧光试剂的实验方案大部分与传统的免疫荧光 (IF)实验相同，但Duolink® PLA技术具有更高的特异性和多功能性。并且Duolink® PLA增加的扩增步骤带来更高的灵敏度。
明场检测
同传统的免疫组化(IHC)一样，Duolink® PLA明场检测主要用于福尔马林固定石蜡包埋组织切片，但也适用其他样本类型。Duolink® PLA明场检测试剂包括寡核苷酸标记的辣根过氧化物酶(HRP)，加入HRP底物后，会形成可用光学显微镜观察到的酶-底物沉淀产物。
流式细胞术
Duolink® Flow PLA 试剂盒 是一种快速、强大的统计分析工具。该试剂盒用于检测蛋白质的相互作用或亚细胞定位。通过Duolink® PLA与流式细胞术的结合实现高通量数据采集。
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