细胞培养常问问题：细菌内毒素污染

什么是内毒素？

内毒素是细菌衍生的小分子疏水性脂多糖（LPS），其可以容易地污染实验室器皿，并且它们的存在可以显著影响体外和体内实验。它们的存在通过鲎变形细胞裂解物（LAL测定）检测，这种裂解物可以检测低至0.01内毒素单位（EU）/ mL水平的内毒素。内毒素的大小约为10 kDa，但很容易形成高达1,000 kDa的大聚集体。细菌在细胞死亡及活跃生长和分裂时大量释放内毒素。单个大肠杆菌每个细胞含有约2百万个LPS分子。内毒素具有高热稳定性，使得在常规灭菌条件下不可能将其破坏。它们是两亲分子，在溶液中带有净负电荷。由于具有疏水性，它们可能对其他疏水性材料（如实验室中使用的塑料制品）具有很强的亲和力。因此，实验室烧杯、搅拌棒和其他实验室器具携带这种污染就不足为怪了。

Figure 1. Structure and physical properties of bacterial endotoxin. Endotoxins are complex lipopolysaccharides (LPS) present in the outer cell membrane of gram-negative bacteria. Endotoxins consist of a core polysaccharide chain, O-specific polysaccharide side chains (O-antigen) and a lipid component, Lipid A, which is responsible for the toxic effects.

内毒素与外毒素有什么区别？

两者都对细胞培养具有潜在危害。外毒素是有毒物质，通常是蛋白质，由细菌分泌并释放到细胞外。而内毒素是由位于细菌细胞壁内的脂质组成的细菌毒素。外毒素通常被热破坏，而内毒素不能被高温破坏。外毒素具有高抗原性并引发免疫反应，而内毒素则没有。

如何检测内毒素？

鲎变形细胞裂解物测定（LAL测定）是最常用的内毒素检测手段。LAL（来自马蹄蟹）与细菌内毒素脂多糖（LPS）反应，反应后形成可定量的凝胶凝块——LPS是革兰氏阴性细菌的膜组分。内毒素的量以每毫升内毒素单位（EU/mL）表示。一个EU相当于约0.1至0.2 ng内毒素/mL溶液。目前有三种形式的LAL测定，每种形式具有不同的敏感性。LAL凝胶凝块测定可检测低至0.03 EU/mL，而LAL动态浊度法和显色测定法则可检测低至0.01 EU/mL。

Figure 2. LAL assay test principle. The cascade of endotoxin detection in Limulus amoebocyte lysate (LAL) assay starts when the endotoxin LPS reacts with Factor C in and turn, activates the factor B. Factor B turns the gel-forming pro-enzyme into an enzyme. The resulting clotting enzyme is responsible for anchoring the two peptide units in the coagulogen, forming an insoluble gel. Other compounds which also cause the gelation in the amebocyte lysate of the horseshoe crab can interference in the test of bacterial endotoxins. Some of these compounds are (1,3)-β-D-glucans, which lead to false positives in the LAL test.

实验室中发现的内毒素污染的常见来源有哪些？

所有实验室器皿、培养基原料、以及适当的实验室技术的彻底清洁，对于大幅降低细胞培养实验室中的内毒素水平至关重要。另外建议使用过滤装置（例如Stericup^®过滤装置）对所有培养基进行过滤除菌，这样可以在加入到细胞之前消除所有潜在的内毒素。

• 水：高纯度水对每个实验室都至关重要。Milli-Q^® Integral是一款纯水系统，可直接将自来水作为进水，为实验室提供不含内毒素的超纯水。该系统每天能够产出高达300升的纯水和/或超纯水，可满足大多数实验室的需求。此外，我们为所有细胞培养应用提供无内毒素水的一次性瓶子。
• 血清：由于是生物动物来源，胎牛血清在历史上一直是窝藏内毒素的罪魁祸首。然而，如果通过改良过滤手段大幅降低了这一风险。我们的每一批血清都经过内毒素水平测试，以确保高水平的性能。
• 细胞培养试剂：常用试剂，例如大肠杆菌来源重组生长因子、激素、脂质、基础培养基，以及解离试剂，例如胰蛋白酶，都可以是内毒素的来源。我们通过细胞培养测试了我们的所有试剂的内毒素水平。
• 塑料器皿 / 玻璃器皿：玻璃器皿、塑料管和配件应无热原，可重复使用的产品应使用无热原或低内毒素的水冲洗。塑料瓶应通过γ辐射灭菌。
• 用户人为污染：细菌存在于皮肤和头发的所有表面以及唾液中。因此，在处理细胞培养时采用适当的无菌技术很有必要，可最大限度降低系统引入内毒素的风险。

内毒素对细胞培养有什么影响？

内毒素影响体外和体内细胞生长和功能，并且结果异常的成因。在体外，越来越多的证据表明，内毒素会引起细胞培养研究的各种问题。有记录的影响包括刺激白细胞培养物产生组织因子，在马巨噬细胞中诱导产生IL-6，极低水平（小于1 ng/mL）的内毒素即可抑制鼠红细胞集落形成。在体内，内毒素在动物研究中引发炎症反应。注射用产品（疫苗和注射药物）中内毒素的存在可导致致热反应，包括发烧、发冷、不可逆甚至致命的感染性休克。

细胞培养中内毒素的可接受限度是多少？

鉴于与内毒素污染相关的严重风险，美国食品和药物管理局（FDA）已对研究人员应注意的医疗器械和非肠道药物的内毒素浓度设定了限制。目前的FDA限制要求医疗器械的洗脱液低于0.5 EU/mL，如果医疗器械与脑脊液接触，则限值为0.06 EU/mL。

如何预防内毒素污染？

必须使用来自可靠试剂供应商提供的经内毒素测试的试剂、补剂和培养基。在培养细胞之前，使用适当的无菌技术，并彻底冲洗和消毒所有细胞培养塑料器皿和耗材（例如移液管和锥形管）也很重要。

如果培养物被污染，如何去除内毒素？

如果培养物被内毒素污染，建议丢弃所有试剂和细胞，并以新的试剂和细胞开始。但是，如果样品不能丢弃，可以使用试剂来消除内毒素。这些内毒素的去除解决方案借助Triton X-114的胶束特性，从样品中去除LPS内毒素。