分子克隆的问题解决

分子克隆概述

分子克隆用于组装重组 DNA 分子并指导其在宿主生物体内的复制，形成多个 DNA 分子。克隆是指复制一个分子以产生具有相同 DNA 分子的细胞群。这种方法常用于扩增含有全基因或任何 DNA 序列（如启动子、非编码序列和随机片段化 DNA）的 DNA 片段。分子克隆是将目的基因 (GOI) 插入到质粒载体中的过程，然后将该载体插入到表达 GOI 编码的蛋白质的细胞中。一旦蛋白质在细胞中得到表达，这种表达即可用于各种不同的研究（如细胞信号传导、形态学或其他方面）。

克隆不仅是制造一个基因或其他细胞成分的拷贝，而且是改变 DNA 序列中的一个基因，然后复制它。为了扩增活生物体中的任何 DNA 序列，该序列必须与复制起点相连，并且能够指导自身和任何相连序列的繁殖（例如：Rapid DNA去磷及连接试剂盒可被用于克隆）。

分子克隆的重要性/应用

分子克隆可用于以下领域：

• 用于探索蛋白质及其功能。利用重组 DNA，研究科学家可以指导复制（生产重组蛋白），并通过克隆操纵细胞，从而了解更多关于特定蛋白的知识，并将这些知识应用到疾病和病原体等更大规模的研究工作中。¹
• 它有助于探索许多不同物种（包括人类和其他动物）的基因组序列，并创造转基因生物，如除草剂抗性植物等。
• 用于细胞周期、基因组组织、基因表达和基因治疗。它也可用于发现新药和合成新的重组疫苗。
• 由于其简单性、高成本效益、快速性和可靠性，它成为了临床微生物学中的一个重要工具。该技术的工业应用实现了以抗微生物肽和可用作治疗剂的重组细胞因子的形式生产新的抗生素。¹
• 利用该技术开发的基因探针在遗传性疾病的早期诊断、法医调查和常规诊断中发挥了重要作用。¹

分子克隆过程

任何 DNA 片段的克隆基本上涉及以下步骤：

• 选择克隆载体（例如：PSF-OXB20-FLUC - 细菌荧光素酶质粒或PSF-OXB20-BETAGAL - 细菌半乳糖苷酶质粒或PSF-OXB20 - 强细菌启动子质粒以及宿主物种。有关选择载体的指导帮助，请参阅我们的表达载体选择指南
  
• 载体DNA的制备（例如：GenElute™质粒中抽试剂盒，来自大肠杆菌RRI的质粒DNA）
• 需要克隆的 DNA 片段的制备
• 利用DNA连接酶产生重组DNA（例如：T4 DNA连接酶）
• 将重组 DNA 导入或插入宿主生物体：
• 将 DNA 插入宿主生物体的方式取决于所选择的实验方法（即转化、转导、转染、电穿孔）
• 含有载体序列的生物体的选择
• 筛选具有所需 DNA 插入片段和生物学特性的克隆

关于分子克隆的详细文章可以在分子生物学手册中找到。

在分子克隆过程中，面临着各种各样的可以检查的问题。以下是几个可能的原因和建议的解决方案：

载体选择

在克隆过程中需要考虑这四个DNA 片段；这些DNA片段中任何一个的缺失都可能引起问题：

• DNA 复制起点是必不可少的（在宿主内复制）
• 一个或多个独特的限制性内切酶识别位点（可引入外源 DNA）
• 一种可选择的遗传标记基因，用于确保已摄取载体序列的细胞存活
• 一个额外的基因（用于筛选含有外源 DNA 的细胞）

DNA 片段制备

不完全限制酶（再）消化

• 限制性内切酶不完全切割：需要检查酶的甲基化敏感性，使用推荐的缓冲液与随附的限制性内切酶。清理 DNA 以去除可能抑制酶的污染物。（可能会使用以下产品以获得更好的效果）
  
• 盐抑制：少数酶对盐敏感，因此在消化前需要清洗 DNA。
• PCR 组分抑制：需要在限制性消化之前清洗 PCR 片段。
• 使用错误的缓冲液：必须使用与限制性内切酶一起提供的推荐缓冲液。（双酶切：同时用两种限制性内切酶消化一个 DNA 底物称为双酶切，是一种常见的省时步骤）对于双酶切，需要选择对两种酶都产生最大活性的合适缓冲液。应遵循推荐的方案。如果需要两种不同的培养温度，则应选择最佳的反应缓冲液，并相应地设置反应。
• 如果使用的酶单位太少：通常建议每 μg DNA 使用至少 3-5 单位的酶。
• 培养期短：需要增加培养时间。

消化的DNA作为涂片在琼脂糖凝胶上电泳。

• 限制性内切酶可以与 DNA 底物结合：需要添加SDS 0.1–0.5%（例如：十二烷基硫酸钠溶液）到上样缓冲液中，使酶从DNA中解离。
• 核酸酶污染：使用新鲜、干净的电泳缓冲液和新鲜的琼脂糖凝胶（例如：  琼脂糖，低凝胶温度 ）可能会有所帮助，同时清理DNA。

凝胶上的额外条带或涂片

如果在凝胶中看到比预期更大的条带，这可能表明酶与底物的结合：可能需要降低反应中的单位数，而且向加样缓冲液加入SDS 0.1-0.5%（例如：  十二烷基硫酸钠溶液 ）使酶从底物上解离可能有会有所帮助。

退火温度可能太低：需要确定引物的正确退火温度。（例如：可使用KiCqStart^® SYBR^® Green引物、六核苷酸引物）。

PCR 片段无扩增

这可能是由于以下原因造成的，实验过程中需要检查²：

• 使用错误的引物序列或 PCR 引物中的错误
• 退火和延伸温度不正确
• 引物浓度不正确和聚合酶单位太少：需要根据反应体积使用厂家推荐的引物浓度和聚合酶单位。
• 反应中Mg²⁺浓度、缓冲液pH和循环条件：  需要对扩增反应进行高度优化。

利用 DNA 连接酶产生重组 DNA

• 最大连接混合物的使用：需要使用推荐量的连接反应进行转化。（例如：QuickLink™ DNA连接试剂盒和Rapid DNA连接试剂盒可用于高效快速连接。
• 低效连接：确认至少有一个片段需要连接含有 5’ 磷酸的基团。纯化 DNA 以去除盐和 EDTA 等污染物。在连接前除去磷酸酶。证实连接酶的活性，通过进行连接控制可能有所帮助。
• 低效磷酸化：  磷酸化前需要对 DNA 进行纯化，以去除可能抑制激酶的过量盐、磷酸盐或铵离子。
• 低效钝化：钝化前加热灭活、去除限制性内切酶或清洗 PCR 片段可能会有所帮助。
• 效率低下的加 A：加 A 前需要清洗 PCR。高保真酶将去除任何非模板化的核苷酸）

连接的 DNA 作为涂片在琼脂糖凝胶上电泳

• 连接酶与 DNA 底物结合：需要用蛋白酶K处理连接反应（例如：  来自白色念球菌的蛋白酶K）在凝胶上电泳之前。

重组 DNA 插入宿主生物体

• 如果细胞不可行：需要计算感受态细胞的转化效率或使用市售的高效感受态细胞。例如：SIG10化学感受态细胞（CMC0001）具有>1 x 10⁹ cfu/μg的高转化效率
• 目的基因 (GOI) 可能对细胞有毒性：需要在较低温度下培养平板或使用对目的 DNA 片段或基因施加更强转录控制的菌株。例如：可使用CONTROLLER SIG10化学感受态细胞。
• 如果使用错误的热冲击方案（对于化学感受态细胞）：需要遵循制造商的具体转换方案，并且在热冲击中使用建议的温度将有所帮助。
• 如果 PEG 存在于连接混合物中（用于电感受态细胞）：转化前需要通过滴透析清洗 DNA。
• 如果电感受态细胞没有记录电压：在连接步骤之前需要清洁 DNA 并除去所有气泡。需要遵循厂家规定的电穿孔参数。
• 构建的 DNA 太大：需要选择能够用大 DNA 构建体高效转化的感受态细胞株，或可使用电穿孔。例如：XLDNA SIG10电感受态细胞可用于大型构建体并提高DNA产量。
• 构建可能易于重组的 DNA 片段：  需要检查。例如：可使用STEADY化学感受态细胞。
• 为了选择含有载体序列的生物体，选择标记（通常是基因）赋予对抗生素的抗性。
  错误的抗生素或抗生素浓度：需要确认抗生素并优化其浓度。用于载体的选择标记也需要确认。例如来自吸水链霉菌的潮霉素B可用作标记。在下面的表格中可以找到一些抗生素及其工作浓度的例子。

表1. 一些常用的抗生素，它们的机理和一般工作浓度。

抗生素名称	类别	行动方式 *	类型	工作浓度 **
卡那霉素 （产品编号K1377）	氨基糖苷	结合 30S 核糖体亚基；导致错误翻译	杀菌	100 mg/L
奇霉素 （产品编号S4014）	氨基糖苷	结合 30S 核糖体亚基；中断蛋白质合成	杀菌	7.5-20 mg/L
氨苄青霉素 （产品编号A6140、A9393和A9518）	β-内酰胺	抑制细胞壁合成	杀菌	20-60 µg/mL
羧苄青霉素 （产品编号C3416）	β-内酰胺	抑制细胞壁合成	杀菌	100 µg/mL
博来霉素 （产品编号B5507）	糖肽	诱导 DNA 断裂	杀菌	10-100 µg/mL
红霉素 （产品编号E6376）	大环内酯	阻断 50S 核糖体亚基；抑制氨酰基易位	抑菌	50-200 mg/L
多粘菌素B （产品编号P1004）	多肽	改变外膜通透性	杀菌	10-100 µg/mL
四环素 （产品编号T3383）	四环素	结合 30S 核糖体亚基；抑制蛋白质合成（延伸步骤）	抑菌	10 mg/mL
氯霉素 （产品编号C0378）		结合 50S 核糖体亚基；抑制肽基易位	抑菌	10-20 µg/mL
*在原核细胞中。 **溶于超纯水和无菌过滤器，除非另有说明。

除了故障排除指南中显示的可能原因之外，以下问题还可能导致转换效率低或无转换效率相，并且可以进行检查。

• DNA 中的杂质：使用化学感受态细胞时需要从DNA溶液中去除苯酚、蛋白质、去污剂和乙醇（即BL21(DE3)）。当使用电感受态细胞时，乙醇在连接过程中沉淀以清除质粒 DNA，即BL21(DE3)（因为盐和缓冲液强烈抑制电穿孔并增加电弧放电的风险）。DNA 也可以溶于无菌水中，以检查其他杂质。
• 过量的 DNA 或体积：这需要检查，只需要根据使用的细胞类型准备推荐的体积。
• 抗生素耐药性表达低或差：推荐将 S.O.C. 培养基用于表达，而不是 LB 培养基，因为后者将转化效率降低了 2-3 倍。
• 感受态细胞保存及处理不当：将感受态细胞储存在 -80 °C 温度下而不是液氮中。感受态细胞应在解冻后立即使用，并在冰上保持低温直至使用。尽量减少冻融循环次数。
• 细胞生长缓慢或无生长或生长过度：使用推荐的温度可能有助于细胞的正常生长。对于过度生长，需要特别注意使用的抗生素及其浓度。
• 计算错误：确保使用正确的稀释因子和 DNA 量来计算效率。

克隆筛选

没有质粒的菌落：

• 抗生素用量不足： 需要将平板上的抗生素水平提高到推荐量，使用新鲜平板上的新鲜抗生素可能有所帮助。请参阅表 1。
• 卫星菌落选择：需要选择大型、已成形的菌落进行进一步分析。
  （卫星菌落是在抗生素抗性菌落周围生长的非常小的细胞菌落，它们摄取了错误的质粒。抗生素抗性菌落释放降解抗生素的酶。卫星菌落在转移到新鲜培养基时不会生长，因此不考虑进一步分析。）

包含错误/不正确构造的菌落可能是由于：

• 质粒（载体）的重组
• 克隆过程中使用的 PCR 扩增子不正确：需要优化 PCR 条件。 
• 内部识别站点的存在：需要分析插入序列是否存在内部识别位点。
• 序列中存在突变/错误：
  • 使用低保真度 DNA 聚合酶：使用具有校对活性的高保真 DNA 聚合酶，例如：进一步重新运行测序反应可能会有所帮助。
  • 从凝胶中切除时受紫外线损伤的 DNA：建议在从琼脂糖凝胶中切除 DNA 时使用长波长 UV (360 nm) 灯箱。

PCR 克隆的考虑

• 使用的插入片段或片段的性质：PCR 片段的效率因片段大小、插入毒性和插入片段的复杂性的差异而变化。
• 插入大小：DNA 的小片段被认为是高效的。
• 载体——插入片段比率：  优化载体与插入片段的摩尔浓度比对于高效克隆是非常必要和关键的。
• 清洁 PCR 产物的使用：建议使用干净的 PCR 产物，在某些情况下应使用新鲜的产物。（例如：rAPid碱性磷酸酶可用于清除PCR产物中的dNTP）。
• 使用阳性和阴性对照：必须有适当的阳性和阴性对照来评价克隆事件的结果。
• 载体和插入片段 DNA 末端的相容性：该操作需要检查，并且为了成功克隆，必须使用正确的聚合酶与克隆载体。使用 SnapFast™ 载体使克隆变得更高效和容易，因为它使 DNA 从一个载体转移到另一个载体变得容易。它与许多预先存在的克隆载体和一系列穿梭载体兼容，以高成功率促进基因转移。
• 正确设计正向和反向 PCR 引物以及探针至关重要。³

参考文献

1. Sharma K, Mishra AK, Mehraj V, Duraisamy GS. 2014. Advances and applications of molecular cloning in clinical microbiology. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 30(1):65-78. https://doi.org/10.1080/02648725.2014.921501

2. Roux KH. 2009. Optimization and Troubleshooting in PCR. Cold Spring Harbor Protocols. 2009(4):pdb.ip66-pdb.ip66. https://doi.org/10.1101/pdb.ip66

3. Raso A, Mascelli S, Nozza P, Ugolotti E, Vanni I, Capra V, Biassoni R. 2011. Troubleshooting fine-tuning procedures for qPCR system design. J. Clin. Lab. Anal.. 25(6):389-394. https://doi.org/10.1002/jcla.20489

4. Canene-Adams K. 2013. Explanatory Chapter.271-278. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-418687-3.00022-7

5. Lorenz TC. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. JoVE.(63): https://doi.org/10.3791/3998

6. Fulton TL, Stiller M. 2012. PCR Amplification, Cloning, and Sequencing of Ancient DNA.111-119. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-516-9_15

7. Mergulhão F, Kelly A, Monteiro G, Taipa MA, Cabral JM. Troubleshooting in Gene Splicing by Overlap Extension: A Step-Wise Method. MB. 12(3):285-288. https://doi.org/10.1385/mb:12:3:285

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