细胞培养实验方案5：悬浮细胞系的传代培养

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

目标

一般而言，源自血液的细胞系（例如淋巴细胞）在悬浮培养物中生长。细胞可以单细胞或成团生长（例如，EBV转化的淋巴母细胞系）。对于这些类型的细胞系，通过稀释进行继代培养相对容易。但是，对于成团生长的细胞系，可能需要通过离心将细胞置于单个细胞悬液中，并在计数前通过移液以较小的体积重新悬浮。

材料

• 细胞培养基 — 预热到适当的温度（有关正确的培养基和温度，请参阅ECACC细胞系数据表）
• 70％ (v/v) 乙醇无菌水溶液(793213)
• 台盼蓝溶液 (T8154)

设备

• 个人防护装备（无菌手套、实验室外套、护目镜）
• 设置到适当温度的水浴
• 适当密封水平的生物安全柜
• 培养箱
• 预先标记的培养瓶
• 倒置相差显微镜
• 离心机
• 类似Scepter™细胞计数器的血细胞计数板或自动细胞计数器。
• 马克笔
• 移液管
• 安瓿瓶架
• 纸巾

操作流程

1. 使用倒置相差显微镜观察培养物。处于指数生长期的细胞应表现为明亮、圆形和有折光性。杂交瘤可能非常粘，需要轻轻敲击培养瓶以分离细胞。EBV转化的细胞会以十分难以计数的非常大的团块形式生长，并且大团块的中心可能细胞无法存活。
2. 从细胞悬液中取出少量细胞样本（100-200μL）并对细胞进行计数。计算细胞/mL，将所需数量的细胞重新稀释到刚准备好的培养瓶中，无需离心，只需将细胞稀释即可。有关推荐的接种密度，请参阅细胞系随附的数据表。
3. 每2-3天重复一次。

要点

1. 如果细胞系是杂交瘤或其他能够产生感兴趣物质（例如重组蛋白或生长因子）的细胞系，请保留用过的培养基进行分析。
2. 如果需要浓缩细胞，则以150xg离心5分钟，然后重悬至合适的体积，然后转移至培养皿中。 

图 1. 悬浮细胞系举例。冷冻/融化后24小时（A）和72小时（B）的Jurkat E6.1细胞显示出典型的悬浮淋巴细胞形态。当细胞融合率达到80%时，应仔细监测和传代。