使用分子印迹聚合物SPE提取安非他明及相关药物

Christine Widstrand, Staffan Bergström, Anna-Karin Wihlborg¹, An Trinh²

¹MIP Technologies AB, Scheelevägen 22, 220 07, Lund, Sweden, ²Supelco, 595 North Harrison Road, Bellefonte, PA, 16823, USA

Reporter US Volume 26.1

an.trinh@sial.com

简介

安非他明和安非他明相关药物往往含有兴奋剂和致幻剂，常被学生、运动员和消遣吸毒者使用。过去15年中，这些药物的滥用已成为一个全球性问题。2004年，美国有超过17,000个甲基苯丙胺实验室被缉获；因此，2005年制定的“打击甲基苯丙胺法”于2006年被签署成为法律，以规范麻黄素、伪麻黄碱、以及苯丙醇胺等产品的非处方销售，以免其被用作非法制造安非他明和甲基苯丙胺的前体(1)。2005年欧洲毒品和毒瘾监测中心的一份报告显示，整个欧洲的安非他明和摇头丸的使用一直在增加(2)。近年来，各种筛选/检测技术已经可以通过市场购买到，例如ELISA和其他基于免疫的比色和即时检测（POC）试剂盒/装置。尽管此类检测方法快速有效，但多数不具有选择性，仅能检测某些安非他明而非其他类别安非他明 (3)。另外部分检测方法选择性不足、能够识别非常广泛的拟交感神经胺，但阳性预测值（PPV）可在0-90％范围内波动(4)。鉴于上述两种情况，人们需要另一种高选择性的类别特异性检测方法，验证基于免疫的筛查结果。

在本报告中，我们描述了一种简单、快速且具有选择性的方法：通过分子印迹聚合物SPE(SupelMIP^™)从尿样中提取微量苯丙胺相关药物——这种聚合物专门用于选择性提取苯丙胺相关药物（图1）。同时，我们也将SupelMIP技术与最近发表的使用常规亲水聚合物SPE相的提取技术进行了比较(5)。

图 1. 安非他明及相关药物的化学结构

分子印迹聚合物

分子印迹聚合物（MIPs）是一类高度交联、基于聚合物的分子识别元件，可高度选择性结合特定目标化合物或结构相关化合物。在MIP合成期间，通过可以模拟分析物的模板分子，引导形成与目标分析物空间上和化学互补的特定空腔或印迹，实现选择性。因而，在MIP空腔和分析物官能团之间可发生多种相互作用（例如，氢键、离子、范德华、疏水性）。MIP相与其目标分析物之间的强保留作用力支持在固相提取期间更彻底地洗涤，从而在分析前充分纯化样品。

由此可以获得更洁净的提取物、更低的检测限、以及更有效的样品纯化工艺。选择腔的图示如图2所示。

图 2. 选择性MIP腔图示

苯丙胺和安非他明相关药物的提取与分析

使用SupelMIP SPE和常规亲水聚合物SPE，通过表1中所述的步骤从尿样提取苯丙胺和相关药物甲基苯丙胺、芬特明、MDA、MDMA、以及MDEA。通过LC-MS-MS进一步分析提取物（表2）。

表1. SupelMIP SPE -安非他明方法与常规亲水聚合物SPE方法的比较(53228-U)

SupelMIP SPE- 安非他明方法	使用常规亲水性聚合物SPE相的公开苯丙胺方法(5)
样品预处理	样品预处理
向人类尿样中加入内标（甲基安非他明-d3 和MDM A-d5），并用pH 8的10mM乙酸铵缓冲液1:1 (v/v)稀释。 使用NH或HAc 将pH调节至7.5-8.5 SPE操作步骤	将内标加入人体尿样。用5 M HCl酸化加标和空白尿样，每10 mL尿液加入100ul。 SPE操作步骤
SupelMIP SPE - 苯丙胺，25 mg / 3 mL（53228-U） 1.用1 mL甲醇和1 mL 10 mM醋酸铵缓冲液（pH 8）调节并平衡MIP相 2.将1 mL预处理样品上样至小柱。 3.按照以下洗涤方案洗涤（洗脱干扰物）： • 2 x 1 mL去离子水（勿让小柱干燥！） • 1 mL 60/40 MeCN/去离子水，然后抽真空5-10分钟（-1 bar，-20 inHg或-70 kPA）以干燥小柱 • 1 mL 1% HAc的MeCN溶液 4.用2 x 1 mL含1％甲酸的甲醇溶液洗脱苯丙胺类药物。在每次分离时施加-0.4 bar（-12 Hg）的压力。 5.在氮气环境下蒸发至干燥，并在LC-MS-MS分析前用150μl液相色谱流动相（90％A和10％B）复溶	常规亲水聚合物SPE相，30 mg / 1 mL 1.  用1 mL甲醇和1 mL去离子水调节并平衡SPE相 2.将1 mL预处理样品上样至小柱。 3.用1 mL含2％氢氧化铵的5％甲醇和1 mL含2％氢氧化铵的20％甲醇洗涤（洗脱干扰物） 4.用0.5 mL 20％甲醇和2％乙酸洗脱苯丙胺类药物 5.在氮气环境下蒸发，并在LC-MS-MS分析前用150μl 液相色谱流动相复溶

表2. LC-MS-MS条件 (581304-U)

色谱柱：	Ascentis C18，15 cm x 2.1 mm，5µm，(581304-U)
仪器：	Shimadzu LC-20/Applied Biosystems/MDS SCIEX APl3200
流动相：	溶剂A - 去离子水 + 0.05% TFA 溶剂B - 乙腈 + 0.05% TFA
梯度：	初始：90% A - 10% B 7 min 70% A - 30% B 10-11 min 10% A - 90% B 11.2 min 90% A - 10% B
温度：	室温
流速：	0.2 mL/min
离子模式：	阳性
离子源：	Turbospray
离子喷雾电压：	5500V
源温：	600 °C
喷撞气：	6 psi
进样体积：	20 µl
检测方法：	MS-MS
MRM 离子对数和保留时间	化合物苯丙胺甲基苯丙胺 甲基苯丙胺D8 苯丁胺 MDA MDMA MDMA D 6 MDEA	Rt (min) 7.8 8.3 8.3 8.7 8.0 8.5 8.5 9.2	Q1/Q3 136/119and 136/91 1S0/119and 1S0/91 1S8/124 and 1S8/93 1S0/133 and 1S0/91 180/163and 180/10S 194/163and 194/10S 199/16S and 199/136 208/163 and108/105

使用SupelMIP SPE实现更低的定量限

将图1中的安非他明药物以15和50 ng/mL的浓度掺入加标尿液中，并用表1和表2所述方法提取/分析。评估并汇总SupelMIP SPE和传统亲水SPE方法（信噪比为10：1）对每种分析物的定量限（LLOQ），如表3所示。SupelMIP方法实现了2.5-43.0pg/mL范围的LLOQ在（比常规亲水聚合物SPE方法低一个数量级）。为了进一步说明SupelMIP SPE提取方法的高选择性，将15μg/mL苯丙胺加入尿液中并进行如上提取/分析。结果表明使用SupelMIP SPE提取法可轻松检测出苯丙胺峰。而使用常规亲水聚合物SPE方法时，未观察到苯丙胺信号（图3）。

表3. SupelMIP SPE与常规亲水聚合物SPE的LLOQ对比

	SupelMIP (pg/mL)	传统 亲水性 聚合物SPE (pg/mL)
甲基苯丙胺盐酸盐	6.6	52
安非他明	7.3	138
芬特明标准液	1.5	141
MDA	4.3	261
MDMA	3.0	56
MDEA	2.5	52

图 3. 使用SupelMIP SPE与常规亲水聚合物SPE纯化添加安非他明的尿样（15 pg/mL）

SupelMIP SPE可改善回收率并减少离子抑制

向尿样中加入图1所列的苯丙胺类药物，含量分别为0.010、0.015、0.50、1.0和5.0 ng/mL，并使用表1和表2所述方法提取/分析。根据氘化内标确定每种添加药物浓度的相对回收率。SupelMIP SPE方法检测所有含量水平的添加药物（MDA除外）均达到了80％以上的相对回收率。而采用常规亲水聚合物方法（数据未显示）时，所有苯丙胺类药物在含量为0.010和0.015 ng/mL时均观察到0％的回收率，含量为0.5、1.0和5.0 ng/mL时仅观察到甲基苯丙胺和MDMA的回收率高于80％。

根据两种SPE操作步骤纯化空白尿样。提取尿样后，向SPE提取物中掺入苯丙胺药物的混合物。利用复溶溶剂制备校准曲线标准品。

在不使用内标的情况下，将校正标准校准曲线与两种方法的基质匹配样品进行比较。表4总结了SupelMIP SPE和亲水聚合物SPE方法在10和100 ng/mL时的离子抑制百分比。从表中可以看出，SupelMIP SPE的离子抑制率明显更低。

表4. SupelMIP SPE与亲水性聚合物SPE的离子抑制率(%)对比

	SupelMIP (ng/mL)		传统 亲水 聚合物SPE (ng/mL)
	10	100	10	100
甲基苯丙胺盐酸盐	0%	3%	31%	12%
安非他明	5%	10%	33%	28%
芬特明标准液	3%	2%	36%	22%
MDA	30%	23%	51%	48%
MDMA	5%	13%	45%	36%
MDEA	10%	4%	65%	52%

结论

本报告展示了分子印迹聚合物SPE（SupelMIP）方法的实用性——该方法可用于从尿液中选择性地提取安非他明及相关药物。与最近发布的传统亲水聚合物SPE方法相比，SupelMIP方法能够减少离子抑制并实现更低的LOQ/LOD（低一个数量级）。高度选择性的SupelMIP方法还可提供更高的回收率和重现性，提高灵敏度、精度和准确度。

参考文献

1. The Combat Meth Act of 2005. Available at: . http://www.deadiversion.usdoj. gov/meth/q_a

2. 2005. European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction, Available at: .. Annual Report . . http://www.emcdda.eu.int/

3. Walsh, Forensic Science International, 2007. In Press .

4. Woodworth A, Saunders AN, Koenig JW, Moyer TP, Turk J, Dietzen DJ. 2006. Differentiation of Amphetamine/Methamphetamine and Other Cross-Immunoreactive Sympathomimetic Amines in Urine Samples by Serial Dilution Testing. 52(4):743-746. https://doi.org/10.1373/clinchem.2005.060616

5. Fuh M, Wu T, Lin T. 2006. Determination of amphetamine and methamphetamine in urine by solid phase extraction and ion-pair liquid chromatography?electrospray?tandem mass spectrometry. Talanta. 68(3):987-991. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2005.06.057