氨基酸衍生化和GC-MS分析

Katherine K. Stenerson

Reporter US Volume 25.3

简介

通常使用高效液相色谱（HPLC）来分析氨基酸。但也可使用液相色谱，而且在某些情况下，出于对仪器可用性或者操作成本的考虑，这种方法会是更好的选择。在液相色谱分析之前，需要衍生化氨基酸的极性性质。衍生化旨在使分析物更易挥发、降低反应性，从而改善其色谱行为。针对氨基酸，衍生化用非极性基团取代OH、NH2和SH极性官能团上的活性氢。

甲硅烷基化是一种非常常用的衍生化技术，可用于多种化合物。该方法的主要缺点是其对水分敏感。如果存在水分，可导致反应产量差，衍生化分析物不稳定。在本研究中，我们评估了甲硅烷基化试剂N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）在氨基酸衍生化中的用途。当与含有活性氢的极性官能团反应时，MTBSTFA形成叔丁基二甲基甲硅烷基（TBDMS）衍生物：

图 1. MTBSTFA结构

MTBSTFA衍生物比使用较低分子量试剂 [例如N，O-双（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）] 形成的那些更稳定且对水分敏感性更低(1)。

实验

将50 μL含有91 μg/mL的L-氨基酸与0.1 N HCl的混合物溶液的等分试样干燥，并加入100 μL纯MTBSTFA，然后加入100μL乙腈。将混合物在100℃下加热4小时。然后用碳酸氢钠中和样品，并在20 m × 0.18 mm I.D. x 0.18μm SLB™-5ms毛细管色谱柱上进行GC-MS分析。

结果

氨基酸TBDMS衍生物的色谱图如图2所示。从尖峰处获得的光谱数据有助于鉴定氨基酸衍生物。用TBDMS基团取代活性氢使分子量增加114。这些衍生物的电子碰撞光谱2含有对应于衍生物分子量减少的典型片段CH₃(M-15)、C₄H₉(M-57)、C₄H₉ + CO (M-85)、和CO-O-TBDMS (M-159)。图3显示了TBDMS-缬氨酸光谱中这种片段模式的一个例子。

图 2. SLB-5ms (28564-U)上氨基酸衍生物的GC-MS分析

图 3. 缬氨酸TBDMS衍生物的质谱（衍生物的MW = 345）

在所用的反应条件下，大多数氨基酸产生一种衍生物，羟基、胺和巯基上的活性氢（在半胱氨酸的情况下）被TBDMS取代。有些氨基酸产生多种衍生物，特别是天冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸。对于上述氨基酸，反应条件的改变，例如降低温度或改变反应时间，可以防止这种情况发生。例如，将反应时间从2小时增加到4小时，导致完全衍生形式的色氨酸的响应增加。

虽然TBDMS衍生物比传统TMS衍生物更稳定，但其较高的分子量导致GC分析期间的洗脱时间更长。为了平衡这一点，用较短、较细的毛细管柱进行分离。为了保持甘氨酸衍生物峰在溶剂中的分辨率，需要不高于100℃的起始温度。在胱氨酸衍生物洗脱后快速升温至360℃，以确保色谱柱清洁，便于后续分析。

结论

该研究表明，通过适当使用衍生化试剂，如MTBSTFA，可对氨基酸进行GC-MS分析。为实现产生目标衍生物的最大响应，可能需要“调整”反应条件。衍生物可形成特征片段，以便进行MS鉴定。为了减少这些衍生物的总GC分析时间，建议使用较短、较细的柱，例如20 m x 0.18 mm I.D. x 0.18 μm SLB-5ms。

参考文献

1. Sobolevsky TG, Revelsky AI, Miller B, Oriedo V, Chernetsova ES, Revelsky IA. 2003. Comparison of silylation and esterification/acylation procedures in GC-MS analysis of amino acids. J. Sep. Science. 26(17):1474-1478. https://doi.org/10.1002/jssc.200301492

2. Kitson FG, Larsen BS, McEwen CN. Gas Chromatography and Mass Spectrometry, A Practical Guide; Academic Press: San Diego, 1996; Chapter 9..

3. Molnár-Perl I, Katona ZF. 2000. GC-MS of amino acids as their trimethylsilyl/t-butyldimethylsilyl Derivatives: In model solutions III. Chromatographia. 51(1):S228-S236. https://doi.org/10.1007/bf02492811