评估Millex^®针头过滤器在药品亚硝胺杂质检测中的应用

• 亚硝胺杂质检测
  • 法规要求
  • 分析方法
  • 样品过滤要求
• 实验方法
• 亚硝胺分析用过滤器评估
  • 可提取物
  • 回收率
• 亚硝胺杂质检测和过滤器选择
• 相关产品
• 相关应用
• 参考文献

亚硝胺杂质检测

药品亚硝胺类杂质的检测和定量对于确保药品的安全和品质至关重要。亚硝胺杂质经由各种难以预测的途径被引入合成工艺中，具有潜在的致癌作用和基因毒性，从而危及患者健康。^1-4药品的原料药和辅料中都曾检出过亚硝胺，导致自2018年来包括缬沙坦在内的多起药品召回事件。^5,6

亚硝胺分析的法规要求

药品监管机构和组织，如美国食品药品监督管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMA)和人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)提供了药品中亚硝胺分析的指南和要求。表1是它们的要点归纳。

表1. 精选药品监管机构组织应对药品中亚硝胺杂质的指南和要求。

机构	亚硝胺杂质指南
美国FDA7	指南提供建议步骤，要求API和药品生产商检测并避免药品中亚硝胺杂质超出可接受限度。 要求药企明确杂质可能来源、评估风险并采取适当措施防止污染。 建议药品中亚硝胺分析方法采用质谱等适合技术。
EMA8	发布指南和建议阐述人用药中亚硝胺杂质的预防、检测和风险控制。 提供各类药品中特定亚硝胺杂质的阈值和限度。 要求生产商开展风险评估、进行检测并向监管机构上报任何亚硝胺杂质发现。
加拿大卫生部9	要求生产商评估和控制产品中的亚硝胺，包括进行风险评估和执行适当的预防措施。
日本医药品医疗器械综合机构(PMDA)10	发布指南阐述药品中亚硝胺杂质的检测和控制。提供有关风险评估、检测方法和预防控制策略的建议。
新加坡卫生科学局(HSA)11	要求药品注册申请人进行产品亚硝胺杂质的风险评估。 制定鉴定和测定药品中亚硝胺杂质的检测方法。
中国台湾FDA12	要求许可证持有者积极评估和检查其药品中亚硝胺杂质的风险。 制定亚硝胺杂质检测的推荐方法。
ICH4	将亚硝胺类物质定为1类杂质，“已知致突变致癌物 ”。  发布ICH指导原则M7，着重在评估和控制药物中DNA反应性（致突变）杂质以限制潜在致癌风险。 旨在统一全球各监管机构和药典的现有方法。

这些监管机构积极地监控并更新亚硝胺杂质相关指南以确保公众健康和安全。药厂在评估和控制药品中亚硝胺污染风险时，务必遵守这些指南和要求。

亚硝胺分析方法

全球监管机构（EMA、美国FDA等）都着重强调了稳健的分析方法对于药品中亚硝胺分析的重要性。LC-MS/MS。这种方法结合了高效液相色谱(HPLC)和串联质谱(MS/MS)，具有高灵敏度、选择性和准确性等优势。LC-MS/MS能检测和定量复杂样品基质中微量级别的各种亚硝胺，适合日常分析，符合监管限度。美国药典通则USP <1469> Procedure 3使用LC-MS/MS方法定量亚硝胺。¹³美国FDA、欧洲药典、¹⁴新加坡卫生科学局(HSA)¹⁵和台湾食品药物管理署¹⁶也发布了测定雷尼替丁等药物中亚硝胺的LC-MS/MS方法。

HPLC联用高分辨率质谱（HPLC-HRMS或LC-HRMS）是亚硝胺分析的另一种重要方法。该方法可选择性区分类似亚硝胺的物质与真正的亚硝胺，保证检测结果的可靠性。美国FDA建立和验证了LC-HRMS方法，并还在¹⁷USP <1469> Procedure 1中总结了这种方法。⁷

HPLC-紫外/可见光检测方法也可用于亚硝胺分析。虽然其灵敏度低于LC-MS/MS法，但可以用作分析原材料、溶剂和辅料的快速方法。法国国家药品和保健品安全署(ANSM)提供两种基于HPLC-UV的分析方法。^18,19

气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)是另一种常用的亚硝胺分析方法，检测灵敏度和特异性好，专用于挥发性亚硝胺。USP <1469>、¹⁰ 台湾FDA¹³和瑞士药监局(Swissmedic)²⁰使用GC-MS/MS法检测亚硝胺，新加坡卫生科学局(HSA)发布基于高分辨精确质量数气相色谱-质谱(HRAM-GCMS)的检测方法。²¹

亚硝胺分析的样品过滤要求

上述分析方法在进样前都需要先过滤样品。过滤是在进样前去除样品和流动相中颗粒的最简单方法，否则会对HPLC仪器性能造成严重影响。颗粒物在缬沙坦等药品中非常常见，主要由制剂溶解过程所引起。滤膜的孔径等级代表其截留样品颗粒的能力，HPLC法通常使用0.45 µm滤膜。使用小颗粒（例如，亚2 µm填料）装填柱子和UHPLC时，建议使用0.2 μm滤膜。值得注意的是，研究显示相同孔径滤膜的截留效率并不一定相同。²²

表2是全球药监部门发布的各亚硝胺分析方法中的过滤步骤。建议过滤时使用针头过滤器。针头过滤器的两个重要属性是滤膜材质和孔径。PVDF和PTFE是发布方法中最常提到的两种滤膜材质，某些情况中也有提及尼龙和亲水聚丙烯（表2）。各方法中的孔径有0.2、0.22和0.45μm。

表2. 精选全球药监发布的亚硝胺杂质分析方法中的过滤要求。

机构	方法	过滤
美国FDA	LC-ESI-HRMS法测定二甲双胍 原料药和成品药中亚硝胺杂质23	“使用0.22 µm PVDF 针头过滤器过滤上清液”
	LC-HRMS法测定ARB药物中的 6种亚硝胺杂质24	“使用0.22 µm PVDF 针头过滤器过滤上清液”
USP10	<1469>亚硝胺杂质
	Procedure 1	“用适合的0.2-μm孔径滤膜过滤溶液。”
	Procedure 3	“使用0.45-μm亲水聚四氟乙烯(PTFE)滤膜 过滤到样品瓶中”
	Procedure 4	“……0.45-μm尼龙滤膜。过滤1 mL样品提取液”
欧洲药典	2.5.42.原料药中的N-亚硝胺
	Procedure A	“通过滤膜（标称孔径0.20 µm） 过滤上清”
	Procedure B Sample Preparation 2	“如有需要，通过滤膜（标称孔径0.45 µm）过滤上清”
法国国家药品和保健品安全署(ANSM)	HPLC/UV法测定沙坦原料药中的NDMA和NDEA12	“过滤等分试样……使用0.45 µm GHP滤膜”
	HPLC/UV法测定缬沙坦原料药和成品中的NDMA13	“过滤等分试样……使用0.45 µm PVDF滤膜”
新加坡卫生科学局(HSA)	LC-MS/MS分析方法测定 · 西药中6种亚硝胺杂质25 · 二甲双胍和雷尼替丁中的N-亚硝基二甲基胺(NDMA)26 · 利福平中的1-甲基-4-亚硝基哌嗪(MNP)27 · 沙丁胺醇中的N-亚硝基沙丁胺醇8	“针头过滤器（PTFE膜 0.2 µm）”
	HRAM-GCMS法测定(NDMA)二甲双胍中的N-亚硝基二甲基胺(NDMA)15	“滤膜(PTFE 0.2 µm)”
台湾食品药物管理署	药品中亚硝胺检测方法 - 多重分析（LC-MS/MS法）29	“滤膜：0.22 μm，PVDF”
	药品中亚硝胺检测方法 - 多重分析（GC-MS/MS法）30	“滤膜：0.22 μm，PVDF”

实验方法

本研究使用之前已经验证过的USP <1469> Procedure 3方法。³¹第一部分研究针头过滤器的亚硝胺杂质可提取物，第二部分研究加标缬沙坦的回收率。LC-MS/MS条件见表3，MRM转换见表4。

表3. LC-MS/MS条件

仪器：	Agilent 1290 Infinity II液相色谱仪—Agilent 6495C三重四极杆质谱仪
色谱柱：	Ascentis® Express C18色谱柱，2.7 µm，15 cm x 2.3 mm
流动相：	[A]水 + 0.1%甲酸，[B]甲醇 + 0.1%甲酸
梯度：	时间（分钟）			A%	B%
			起始	97.0	3.0
			1.5	97.0	3.0
			4.0	50.0	50.0
			7.0	25.0	75.0
			8.1	15.0	85.0
			9.2	5.0	95.0
			12.0	5.0	95.0
			12.1	97.0	3.0
流速：	0.50 mL/min
压力:	初始压力：320 bar 最大压力：460 bar
柱温：	60 °C
检测器：	MS、APCI (+)、MRM（详见表4）
进样体积：	20 µL
样品：	详见文中

表4. 6种亚硝胺杂质的MRM转换

峰	缩写	名称	MRM	碰撞能量(V)
1	NDMA	亚硝基二甲基胺	75.1->43.3	16
2	NMBA	亚硝基甲基苯胺	147.1->117.1	4
3	FDX	亚硝基二乙基胺	103.1->75.1	8
4	NEIPA	亚硝基乙基异丙基胺	117.1->75.1	8
5	NDIPA	亚硝基二异丙胺	131.1->43.3	12
6	NDBA	亚硝基二丁胺	159.2->57.1	12

检测的针头过滤器。以下产品各取2批，每批取3个滤器：(1) Millex^® PVDF 0.22 µm和(2) Millex^® PTFE 0.2 µm。以下产品各取1批，每批取3个滤器：(3)供应商P PVDF 0.2 µm, (4)供应商C H-PTFE 0.2 µm, (5)供应商M PVDF 0.2 µm和(6)供应商M PTFE 0.2 µm。

第一部分：可提取物。为了测定针头过滤器中是否含有基线水平的亚硝胺类可提取物， 按照USP <1469>方法，对仅含有稀释剂（0.1% v/v甲酸水溶液）的样品加标4种同位素标记内标(IS)[10 µg/mL的NDMA-d₆和NMBA-d₃，1 µg/mL的NDEA-d₁₀/NDBA-d₁₈]。样品经涡旋、离心（10,000 rpm，10 min）、取上清液用13 mm针头滤器过滤。采用LC-MS/MS法分析滤液中的6种亚硝胺化合物。使用外标曲线法测定浓度，曲线浓度范围1.33 - 90 ng/mL（NDMA、NMBA、NEIPA、NDIP和NDBA）和0.66-69.4 ng/mL (NDEA)。

第二部分：回收率。按USP <1469>方法，对40 mg缬沙坦（valsartan dura，80 mg）进行粉碎、1%甲酸水溶液稀释、低浓度水平(L2)加标。样品经离心、过滤后，采用LC-MS/MS方法分析。 

亚硝胺分析用过滤器评估

很多LC-MS和GC-MS检测亚硝胺杂质的方法中都涉及色谱分析进样前的样品过滤。这时，确保过滤器中不含有亚硝胺类可提取物对于保证检测数据的准确性和一致性非常重要。另外也需要进行回收率研究，因为某些分子会吸附过滤器组件，影响最终数据质量。

实验采用基于USP <1469> Procedure 3的验证方法评估针头过滤器。²⁷该USP方法描述了通过LC-MS/MS定量分析部分沙坦类药物（缬沙坦、氯沙坦钾、奥美沙坦酯、坎地沙坦酯和替米沙坦）中的NDMA、NDEA、NDIPA、NEIPA、NMBA和NDBA。方法中的“样品溶解(Sample solution)”部分最后一句要求在离心后“使用0.45-μm孔径的亲水聚四氟乙烯(PTFE)滤膜”过滤。¹¹

第一部分：可提取物

使用外标曲线法分析针头过滤器滤液中的亚硝胺可提取物，曲线浓度范围1.33-90 ng/mL（NDMA、NMBA、NEIPA、NDIP和NDBA）和0.66-69.4 ng/mL (NDEA)。图1为这些化合物的MRM谱图示例。

图 1. 亚硝胺标准溶液的MRM谱图。(NDMA、NMBA、NEIPA、NDIP和NDBA为10 ng/mL，NDEA为6.6 ng/mL)

定量限(LOQ)定义为信噪比为10时候的浓度。每种亚硝胺杂质校准曲线的最低浓度的信噪比>10。所有受检的针头过滤器都没有检出等于或高于此浓度的亚硝胺（表5）。

表5. USP Procedure 3法分析各种针头过滤器中亚硝胺可提取物的结果<1469>。

化合物	校准曲线的最低浓度 (ng/mL)	S/N	定量限(LOQ)
			PVDF膜的针头过滤器			PTFE膜的针头过滤器
			Millex®针头过滤器	供应商P	供应商M	Millex®针头过滤器	供应商C	供应商M
NDMA	1.33	>10	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33
NMBA	1.33	>10	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33
FDX	0.66	>10	<0.66	<0.66	<0.66	<0.66	<0.66	<0.66
NEIPA	1.33	>10	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33
NDIPA	1.33	>10	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33
NDBA	1.33	>10	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33	<1.33

缩写：S/N = 信噪比；PVDF = 亲水聚偏氟乙烯； PTFE = 亲水聚四氟乙烯；LOQ = 定量限；ND = 未检出

保证过滤组件不含有任何影响数据质量的化学可提取物十分重要，尤其是在用到高灵敏度仪器的时候。要避免可提取物是因为它们会与分析峰共洗脱，或者在下游分析时显示为超出意料的峰，增加数据解读的难度。可提取物的来源包括过滤器脱落、生产工艺残留化学品或过滤器洗脱时的次生化学试剂。对于特定分析物比如亚硝胺化合物来说，制膜工艺中可能意外引入了这类可提取物。

第二部分：缬沙坦回收率

该回收率实验采用低浓度水平(L2)的标准品制备缬沙坦加标样品。通过LC-MS/MS分析制备好的样品溶液，采用外标曲线法计算各分析物浓度。测定样品溶液和外标溶液中内标信号与分析物信号的比值，例如NDMA-D₆信号/NDMA信号。

表6显示受检PVDF和PTFE针头过滤器的平均回收率。对于所有受检器材，全部化合物的回收率都落在70-130%³¹的可接受范围内。不同化合物和滤器材质的回收率明显有些差别。例如，NDBA的回收率相对较低（仍在可接受范围内），可能是它会与滤器介质或药品成分发生疏水作用。Millex^®的两种亲水性针头过滤器（PVDF和PTFE）均具有批次间一致的回收率。

表6. 6种亚硝胺化合物的平均回收率。每批检测滤器数n=3，检测值为平均值±标准偏差。

化合物	加标浓度(ng/mL)	PVDF膜的针头过滤器			PTFE膜的针头过滤器
		Millex®	供应商P	供应商M	Millex®	供应商C	供应商M
NDMA	2.0	95.6 ± 2.5	95.6 ± 4.0	91.2 ± 1.2	92.7 ± 0.3	94.6 ± 1.0	94.2 ± 1.2
NMBA	2.0	101.1 ± 1.5	99.9 ± 1.6	97.8 ± 0.2	98.6 ± 2.0	97.5 ± 2.3	101.4 ± 0.2
FDX	0.88	101.4 ± 2.6	101.9 ± 1.2	99.0 ± 3.4	102.4 ± 1.9	100.2 ± 1.9	98.6 ± 1.6
NEIPA	2.0	95.6 ± 1.1	94.6 ± 3.7	92.1 ± 1.1	99.5 ± 3.1	94.6 ± 2.7	93.1 ± 1.3
NDIPA	2.0	92.4 ± 3.8	94.8 ± 3.7	91.6 ± 2.5	99.5 ± 0.6	98.1 ± 0.2	99.2 ± 1.5
NDBA	2.0	83.6 ± 1.8	85.4 ± 5.9	83.6 ± 3.9	82.1 ± 0.9	85.5 ± 1.5	84.2 ± 3.2

选择针头过滤器材质时，还需要考虑分析物分子会否吸附过滤器，因为这种结合会降低回收率。受检分子的化学性质和过滤器（滤膜和外壳）的理化性质决定了结合程度。各种次级相互作用，例如静电作用、氢键作用和疏水作用，都会导致分析物吸附滤膜和外壳。³²本研究中，无论使用PVDF还是PTFE滤膜，NDMA的回收率都相对较低（仍在可接受范围内），可能就是因为NDMA与膜发生了疏水作用。PVDF膜的NDIPA回收率偏低，说明该分子对PTFE和PVDF聚合物的作用力有差别。其他带有极性官能团且非特异性结合趋势更高的聚合物，比如尼龙，很有可能结合力更高，分析物损失会更多。因此，为了获得最准确的回收率，建议在样品制备时弃去第1 mL的滤液，比如美国FDA的亚硝胺检测方法所述。^23,24 这样可以保证膜的结合位点已经被分析物饱和，不再造成额外的分析物损失。我们已经发现，就算高结合力的膜材质（如尼龙）也适用这种操作。

亚硝胺杂质检测和过滤器选择

所有受检PVDF和PTFE针头过滤器，按照USP <1469> Procedure 3方法检测的亚硝胺可提取物水平均低于定量限。并且，它们的亚硝胺加标回收率均在可接受范围内，仅不同化合物之间有微小差别。说明这些过滤器介质适用于亚硝胺分析方法的样品制备。

相关应用

• 小分子分析与质控(QC)

  符合国际药典标准的小分子分析和质控(QC)对于药物研发至关重要。分析化学和微生物检测确保小分子的开发和生产符合药品生产质量管理规范(GMP)。

• 药典检验与监管指南

  药典检验对于辅料和药品放行至关重要。USP和EP等国际药典都为此制定了相应的质量标准。进行检验并符合药典方法所述标准，是对药物成分和药品的基本要求。

参考文献

1. Akkaraju H, Tatia R, Mane SS, Khade AB, Dengale SJ. 2023. A comprehensive review of sources of nitrosamine contamination of pharmaceutical substances and products. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 139105355. https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2023.105355

2. Cioc RC, Joyce C, Mayr M, Bream RN. 2023. Formation of N-Nitrosamine Drug Substance Related Impurities in Medicines: A Regulatory Perspective on Risk Factors and Mitigation Strategies. Org. Process Res. Dev.. 27(10):1736-1750. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.3c00153

3. Li K, Ricker K, Tsai FC, Hsieh CJ, Osborne G, Sun M, Marder ME, Elmore S, Schmitz R, Sandy MS. Estimated Cancer Risks Associated with Nitrosamine Contamination in Commonly Used Medications. IJERPH. 18(18):9465. https://doi.org/10.3390/ijerph18189465

4. International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH). 2023. ICH M7(R2) Guideline on assessment and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk.

5. Bharate SS. 2021. Critical Analysis of Drug Product Recalls due to Nitrosamine Impurities. J. Med. Chem.. 64(6):2923-2936. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c02120

6. Maundrell N. 2022. Nitrosamine impurities: from raw materials to final drug product. Bioanalysis. 14(2):63-66. https://doi.org/10.4155/bio-2021-0238

7. FDA. Rigorous Detection of Nitrosamine Contaminants in Metformin Products: Balancing Product Safety and Product Accessibility. . [Internet]. Available from: https://www.fda.gov/drugs/news-events-human-drugs/rigorous-detection-nitrosamine-contaminants-metformin-products-balancing-product-safety-and-product

8. European Medicines Agency (EMA). Nitrosamine impurities. . [Internet]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/human-regulatory-overview/post-authorisation/pharmacovigilance-post-authorisation/referral-procedures-human-medicines/nitrosamine-impurities

9. Health Canada. Nitrosamine impurities in medications: Guidance.

10. Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA). Measures against the risk of nitrosamine contamination in pharmaceuticals. . [Internet]. Available from: https://www.pmda.go.jp/safety/info-services/drugs/0371.html

11. Health Sciences Authority. Nitrosamine impurities in medicines. . [Internet]. Available from: https://www.hsa.gov.sg/therapeutic-products/medicines-quality-and-compliance-monitoring/nitrosamine-impurities-in-medicines

12. Taiwan Food and Drug Administration. 2021 Taiwan Food and Drug Administration Annual Report.

13. USP <1469> Nitrosamine Impurities.

14. European Pharmacopeia. 2.5.42. N-Nitrosamines in active substances.

15. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. Nitrosamine impurities in medicines.. [Internet]. Available from: https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/compliance-enforcement/information-health-product/drugs/nitrosamine-impurities/medications-guidance.html

16. Taiwan Food and Drug Administration. Analytical Methods. . [Internet]. Available from: https://www.fda.gov.tw/eng/siteList.aspx?sid=10360

17. Yang J. 2021. LC-HRMS Based Analytical Platform to Determine Nitrosamines in Pharmaceuticals: Modern Analytical Techniques To Meet Regulatory Needs. 2021 FDA Science Forum.

18. Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM). Method reference: 19A0416-01. Determination of NDMA and NDEA in SARTAN drug substances by HPLC/UV.

19. Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM). Method reference: 18A0399-02. Determination of NDMA in valsartan active substances and finished products by HPLC/UV.

20. Swissmedic. Test method 31_PV_171: Nitrosamines by GC-MS/MS.

21. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. 2021. Test method for determination of N-Nitrosodimethylamine (NDMA) in metformin products by HRAM-GCMS.

22. The Importance of Filtration in Optimizing (U)HPLC and LC-MS Performance.. [Internet]. Available from: /SG/zh/technical-documents/technical-article/analytical-chemistry/small-molecule-hplc/hplc-filtration-performance-optimizing#filtration-column

23. FDA. 2020. Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-High Resolution Mass Spectrometry (LC-ESI-HRMS) Method for the Determination of Nitrosamine Impurities in Metformin Drug Substance and Drug Product.. [Internet]. Available from: https://www.fda.gov/media/138617/download

24. FDA. 2019. Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS) Method for the Determination of Six Nitrosamine Impurities in ARB Drugs.. [Internet]. Available from: https://www.fda.gov/media/125478/download

25. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. 2021. Test method for determination of six nitrosamine impurities in western medicines by LC-MS/MS.

26. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. 2021. Test method for determination of N-Nitrosodimethylamine (NDMA) in metformin and ranitidine products by LC-MS/MS.

27. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. 2021. Test method for determination of 1-Methyl-4-Nitrosopiperazine (MNP) in rifampicin.

28. Health Sciences Agency (HSA) of Singapore. 2021. Test method for determination of N-Nitroso Salbutamol in salbutamol products by LC-MS/MS.

29. Taiwan Food and Drug Administration. 2020. Method of Test for Nitrosamines in Medicines - Multiple Analysis (LC-MS/MS Method).

30. Taiwan Food and Drug Administration. 2020. Method of Test for Nitrosamines in Medicines - Multiple Analysis (GC-MS/MS Method).

31. Muller T, Appelblad P. 2023. Nitrosamine testing using LC-MS methods using USP General Chapter <1469>. Analytix Reporter. 14:15-19.

32. Filter Validation Studies for Pharmaceutical QC – Factors Affecting Analyte Binding. . [Internet]. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/technical-article/analytical-chemistry/filtration/millex-filter-analyte-binding