酶法去糖基化

概览

从糖蛋白中去除碳水化合物有很多原因：

• 为了简化糖蛋白肽段的分析
• 为了简化多糖成分的分析
• 为了在X射线晶体学分析中，去除糖蛋白中的异质性
• 为了去除抗原中的碳水化合物表位
• 为了增强或降低糖蛋白疗法的血液清除率
• 为了探讨碳水化合物在酶活性和溶解度中的作用
• 为了研究配体结合
• 用于糖蛋白药品的质量控制

从多糖中连续水解单个单糖可用于阐明多糖组分的结构和功能。由于目前可用的糖酵解酶的特异性的限制，在许多情况下还需要单个单糖的连续水解，以便酶促完全去除多糖成分。这在许多O链糖的酶去糖基化中尤其如此。

N链多糖策略

使用PNGase F酶是从糖蛋白中去除几乎所有N链寡糖的最有效方法。寡糖保持完整，因此，适合进一步分析（去除糖的天冬酰胺残基脱氨基为天冬氨酸，对蛋白质的唯一修饰）。以寡糖连接的天冬酰胺为中心残基的三肽是PNGase F的最小底物。

图 1. 缩氨酸-N-糖苷酶F

然而，含有岩藻糖a ( 1 - 3 ) -连接到天冬酰胺连接的N乙酰氨基葡萄糖的低聚糖，通常存在于来自植物或寄生虫的糖蛋白中，它对从杏仁粉中分离的肽- N糖苷酶A ( PNGase A )具有抗性，必须在这种情况下使用。然而，当唾液酸存在于N链寡糖上时，这种酶是无效的。其他常用的内切糖苷酶，如内切糖苷酶H和内切糖苷酶F系列不适用于N链糖的一般去糖基化，因为它们的特异性有限，并且因为它们在天冬酰胺上留下一个N-乙酰葡糖胺残基。

空间位阻可能减缓或抑制PNGase F在某些糖基化位点的作用。用SDS和2-巯基乙醇加热使糖蛋白变性和还原，可大大提高去糖基化率。

通过单糖的顺连续去糖基化，所有复合寡糖都可以通过解神经氨酸酶、b-半乳糖苷酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的选择性水解被还原成三甘露糖基二乙酰基壳聚糖核心，这是E-DEGLY试剂盒的一部分。在某些情况下可能需要岩藻糖苷酶。