使用Amicon^®Pro纯化超滤管清除去垢剂

去垢剂常用于在纯化时溶解蛋白和核酸，但同时它本身也会干扰下游分析。游离的去垢剂可通过各种方法去除¹，但与大分子非共价结合的去垢剂只能置换而不能完全去除。幸好对于大多数下游分析而言，清除游离的去垢剂已经足够。

Amicon^® Pro纯化超滤管可高效滤除蛋白或核酸溶液中的去垢剂。选择滤器时要考量特定去垢剂的临界胶束浓度(CMC)。浓度超过CMC后，去垢剂单体会聚集形成分子结构剧变的胶束。为超滤装置选择适宜的截留分子量（即标称分子量限值，NMWL）可更为高效地滤除去垢剂。

难点在于选择的截留分子量要能滤除去垢剂，但不能滤除目标蛋白。基于大小滤除时，由于会形成大的胶束，很多去垢剂要求滤膜的NMWL高达100 kDa，如此造成样品中的目标蛋白损失。对于这类去垢剂，为了减小超滤膜孔径，可先稀释样品减少胶束形成。

Amicon^® Pro系统可通过连续洗滤法清除去垢剂，即在过滤的同时连续补加不含去垢剂的缓冲液，保持样品体积恒定。这种方法获得的去垢剂清除效率和蛋白回收率高于不连续洗滤或透析法。使用Direct Detect^®红外光谱仪可同时监测去垢剂清除和蛋白回收情况。

如需了解去垢剂清除监测方法的更多信息，请参阅我们的技术文档《中红外光谱法分析蛋白样品中的去垢剂》(Detergent Analysis in Protein Samples Using Mid-Infrared (MIR) Spectroscopy)。

方法

1. 根据需要，先用Steriflip^® 0.45 µm滤器或Millex^® 0.45 µm针头式滤器澄清待分析样品。
2. 使用Direct Detect^®光谱仪检测起始材料中的去垢剂和蛋白质浓度。关于如何使用目标去垢剂的8点稀释法和仪器软件的“lipid calibration wizard”进行光谱仪的校准，请查阅我们的Direct Detect^®使用说明书及技术文档。
3. 将50-100 µL澄清样品加入Amicon^® Ultra 0.5 mL超滤管（Amicon^® Pro系统提供）
4. 将超滤管与Amicon^® Pro置换装置组装。
5. 将1 mL磷酸缓冲液加入置换装置/Amicon® Ultra 0.5 mL超滤管组件。装配整个Amicon^® Pro装置。
   （Amicon^® Pro装置可安全容纳9 mL缓冲液。不过，仅加入1.0 mL新鲜缓冲液即可高效达成1000倍的缓冲液置换，因为连续洗滤法可使样品不断接触新鲜的、不含去垢剂的缓冲液。）
6. 在吊桶式转子中4,000 x g离心30分钟。
7. 取出并拆卸Amicon^® Pro装置。
8. 将Amicon^® Ultra 0.5 mL收集管盖住Amicon^® Ultra 0.5 mL超滤管顶部并倒转。
9. 定角转子1,000 x g离心2分钟回收样品。
10. 使用步骤2中的Direct Detect^®光谱仪检测回收蛋白浓度，并确认去垢剂置换。

使用Amicon^® Pro系统清除去垢剂的结果示例

清除2 mg/mL IgG中的0.5% 脱氧胆酸钠。使用溶于0.5%脱氧胆酸钠的2 mg/mL IgG，Amicon^® Pro纯化系统可通过基于大小的超滤法轻松清除稀释至CMC以下浓度的去垢剂。

下图比较了连续洗滤法和逐次稀释及浓缩法的去垢剂清除。连续洗滤法使游离去垢剂浓度始终保持在临界胶束浓度(CMC)下。因此，形成的胶束比逐次稀释和浓缩法更少，并且超滤技术可更加高效地清除去垢剂。

连续洗滤法还能避免蛋白在不含去垢剂的缓冲液中过快浓缩，以至于破坏去垢剂与蛋白之间稳定的相互作用，引起蛋白沉淀而降低收率。

在去垢剂清除时检测去垢剂清除率和蛋白回收率，可检验实验是否把握住这两个过程的最佳平衡。

50 µL蛋白样品的去垢剂清除，同时监测去垢剂清除率(A)和蛋白收率(B)。灰条代表使用10x、20x、30x不含去垢剂的缓冲液通过连续洗滤法清除去垢剂的结果，黑条代表10x、20x、30x稀释样品后通过超滤浓缩法清除去垢剂的结果。注意，当样品仅稀释10倍时，传统的超滤浓缩法并未清除任何去垢剂(A)。

参考文献

1. Das C, Nadler T, Strug I. 2015. Detergent Analysis in Protein Samples Using Mid?Infrared (MIR) Spectroscopy. Current Protocols in Protein Science. 81(1): https://doi.org/10.1002/0471140864.ps2912s81