RIP试剂盒的哺乳动物细胞Ago抗体-RNA免疫沉淀实验方案

试剂

货号	说明
RIP	Imprint® RNA免疫沉淀试剂盒
SAB4200085	AGO2单克隆抗体，大鼠，克隆号11A9
R9255	兔抗大鼠IgG（全分子）抗体 （又名兔抗大鼠）
I4131	大鼠血清IgG
09691	乙酸铵溶液，5M
Ambion AM9520	线性丙烯酰胺(5 mg/mL)
I9516	2-丙醇

剧烈/严格洗涤溶液配制用试剂

I8896	IGEPAL® CA-630
S5150	氯化钠溶液，5M

准备细胞

1. 细胞培养至约80%融合度。  每次RIP约需2百万细胞，或约4百万细胞，用于Ago2和IgG（阴性对照）的2次RIP
2. 用HBSS（体积 = 培养基）清洗细胞
3. 如细胞贴壁，加入胰蛋白酶-EDTA溶液反应约5分钟进行解离，接着加入4-5倍体积的含血清液体灭活
4. 细胞计数，按2百万细胞/管分装，并按4 ^oC、1000 rpm、5 min离心沉淀。弃上清。
5. 用冰冷的PBS（体积 = 弃液）洗涤2次。
6. 弃上清，加入200 µL温和或剧烈的裂解缓冲液 + 蛋白酶抑制剂复合物(PIC)(P8340) + 核糖核酸酶抑制剂（RNase抑制剂）(R1158)/细胞沉淀

试剂	1份RIP	2.1份RIP
裂解缓冲液	0.2	0.42 mL
PIC（蛋白酶抑制剂复合物）	2.0	4.2 µL
RNase抑制剂	0.8	1.68 µL

7. 冰上孵育15分钟（或-80 ^oC保存）
8. 按4 ^oC, 16,000g, 10 min离心沉淀碎片
9. 将上清转移至新管
10. 每份细胞裂解液取10 µL作为5% input（5%起始样）并置于冰上保存

准备磁珠

1. 在1.5 mL试管中，将40 µL蛋白A磁珠加入200 µL洗涤缓冲液，用于2次RIP(IgG & Ago2)
2. 将管子放在磁力架上处理，弃液
3. 用200 µL洗涤缓冲液洗涤1次
4. 用200 µL洗涤缓冲液重悬
5. 加入5 µg兔抗兔IgG（全分子）抗体(R9255)
6. 室温振荡孵育30 min。
7. 稍微离心，在磁力架上弃液
8. 用1 mL洗涤缓冲液洗涤2次。
9. 用200 µL洗涤缓冲液重悬，并分装为2 x 100 µL
10. 加入2.5 µg大鼠IgG(I4131)或大鼠抗AGO2单克隆抗体，克隆号11A9(SAB4200085)。
11. 室温振荡孵育30 min。
12. 稍微离心，在磁力架上弃液
13. 用0.5 mL洗涤缓冲液洗涤2次。
14. 在磁力架上充分除去洗涤缓冲液。

进行RIP反应

1. 准备免疫沉淀缓冲液(IP Buffer)：

试剂	份数	2.1 x 温和	2.1 x 剧烈
洗涤缓冲液	1	0.63 mL	1.68 mL
PIC（蛋白酶抑制剂复合物）	10	6.3 µL	16.8 µL
RNase抑制剂	4	2.52 µL	6.72 µL

1. 用0.2 mL IP Buffer重悬磁珠沉淀
2. 确认每份细胞裂解液已取5% input于冰上保存
3. 温和裂解的细胞加入0.1 mL IP Buffer/cells，剧烈裂解的细胞加入0.6 mL/cells
4. 将稀释后的裂解液与重悬磁珠混合
5. 4 ^oC振荡孵育

清洗

1a.温和洗涤时，洗涤5次，每次加入1mL洗涤缓冲液，涡旋振荡后稍微离心，在磁力架上收集磁珠并弃
上清
1b.剧烈或严格洗涤时，需进行1x 1ml洗涤缓冲液，2x 1mL严格洗涤缓冲液和2x 1mL标准洗涤缓冲液

严格洗涤缓冲液

试剂	起始	最终	10 mL
洗涤缓冲液		1	10 mL
100% Igepal	0.05	1	0.095 mL
5 M NaCl	0.15	0.9	1.5 mL

2. 最后一次洗涤后，用0.2 mL洗涤缓冲液重悬
3. 用洗涤缓冲液将保存的input样定容至0.2 mL  

纯化RNA

1. 每份0.2 mL RIP或input加入0.5 mL Tri Reagent (T9424)
2. 每份再加入0.1 mL氯仿(C2432)，充分涡旋后进行4^oC, 16,000g, 10 min离心
3. 准备1.5 mL管，含
   6 µL线性丙烯酰胺(Ambion; 5mg/mL)
   60 µL 5M乙酸铵(09691)
   600 µL 2-丙醇(I9516)
4. 将上述溶液转移至管中，涡旋后-80 ^oC沉淀至少1小时
5. 冰上解冻-80 ^oC管
6. 按4 ^oC, 16,000g, 10 min离心
7. 小心倒掉上清
8. 用0.5 mL 70%乙醇清洗1次
9. 按4 ^oC, 16,000g, 10 min离心
10. 小心倒掉上清，在层流罩中干燥沉淀
11. 每份用10 µL无RNA酶的水重新水化

试剂

Imprint RNA免疫沉淀试剂盒	RIP
RIP试剂盒组分：
温和裂解缓冲液	B0314
剧烈裂解缓冲液	B0439
RIP洗涤缓冲液	B0564
蛋白A磁珠	B0689
核糖核酸酶抑制剂	R1158
蛋白酶抑制剂混合物，1 X 1ML	P8340

其他试剂

AGO2单克隆抗体，大鼠，克隆号11A9	SAB4200085
兔抗兔IgG（全分子）抗体	R9255
大鼠血清来源IgG	I4131
TRI Reagent提取试剂	T9424
氯仿	C2432
乙酸铵溶液，5M	09691
2-丙醇	I9516
线性丙烯酰胺(5 mg/mL)	Ambion AM9520

剧烈/严格洗涤溶液配制用试剂

IGEPAL CA-630	I8896
氯化钠溶液，5M	S5150