Imprint^®甲基化DNA定量试剂盒（MDQ1）实验方案

• 产品描述
• 试剂盒组件
• 储存方法/稳定性
• 工作流程
• 试剂制备
• 操作流程
• 计算
• 故障排除
• 需要但未提供的材料和试剂
• 材料
• 参考文献

注意：储存温度 - 参见“储存/稳定性”章节了解单个组分的储存条件

产品描述

DNA甲基化已被充分证明在基因表达的调节中起重要作用。在任何给定的时间内，哺乳动物基因组中都有约70％的总CpG二核苷酸被甲基化。基因组中的低甲基化和超甲基化能够调控基因的表达。测定DNA的甲基化状态是表观遗传学研究的一项重要工具。^8,11

已在多种癌症、神经系统疾病、自身免疫性疾病（例如狼疮和心血管疾病）和衰老中都观察到了偏离正常的总体DNA甲基化水平。¹⁰

Imprint甲基化DNA定量试剂盒提供了一种可在约半天内完成对整体DNA甲基化变化进行高通量、非放射性测定的方法。

该试剂盒包含检测甲基化DNA相对水平的全部试剂。最高200 ng的纯化DNA会结合到检测条的孔中。甲基化DNA是通过使用捕获和检测抗体而被检测到的，并随后通过比色法进行定量。存在于样品中的甲基化DNA量与测量得到的吸光值成正比。

提供一组甲基化DNA对照。可绘制标准曲线（范围：10-100 ng）或使用单一量的DNA作为阳性对照。由于总体甲基化水平可能因组织、正常或疾病状态而异，因此建议对不同DNA浓度的样本设置重复以确保生成的信号落在所使用酶标仪的检测范围内。

该试剂盒可允许客户测定两个不同DNA样品的相对甲基化状态。

试剂盒组件

试剂	货号	48 Rxn	96 Rxn
10x 清洗缓冲液	W4267	11 mL	22 mL
DNA结合液	D8568	1.5 mL	3 mL
甲基化对照DNA（50 ng/μL）	M8570	16 μL	32 μL
封闭液	B6561	1.5 mL	20 mL
捕获抗体	C3493	10 μL	20 μL
检出抗体	D8818	10 μL	25 μL
显影液	D8693	6 mL	12 mL
终止液	S3447	3 mL	6 mL
8孔检测条	A4231	6条	12条

储存方法/稳定性

该试剂盒在冰上运输，但不同组分应按下表所示进行储存。

试剂	货号	储存温度
10x 清洗缓冲液	W4267	2-8 °C
DNA结合液	D8568	2-8 °C
甲基化对照DNA（50 ng/μL）	M8570	-20 °C
封闭液	B6561	-20 °C
捕获抗体	C3493	2-8 °C
检出抗体	D8818	2-8 °C
显影液	D8693	2-8 °C
终止液	S3447	2-8 °C
8孔检测条	A4231	2-8 °C

工作流程

制备说明

1 x 洗涤缓冲液

对于48次反应的试剂盒，将11 mL 10x 洗涤缓冲液加入至99 mL分子生物学级的水中。在室温下可保存长达六个月。

对于96次反应的试剂盒，将22 mL 10x 洗涤缓冲液加入至198 mL分子生物学级的水中。在室温下可保存长达六个月。

DNA稀释液

将样品或对照DNA在DNA结合液中进行稀释。每孔可最结合最高200 ng的总DNA。

操作流程

DNA结合

1. 向每孔中加入30 μL稀释于DNA结合液中的DNA。通过左右轻轻倾斜来确保溶液覆盖孔的底部。DNA结合液单独可作为空白对照。
2. 覆盖并在37 °C孵育60分钟。
3. 直接向每孔中加入150 μL封闭液。
4. 覆盖并在37 °C孵育30分钟。
5. 将每孔中的DNA和封闭液吸走。
6. 用150 μL 1x 洗涤缓冲液洗涤三次。

甲基化DNA捕获

7. 在1x 洗涤缓冲液中按1:1000稀释捕获抗体。
8. 向每孔中加入50 μL稀释后的捕获抗体。
9. 覆盖并在室温孵育60分钟。
10. 将孔中的稀释后捕获抗体吸走。
11. 用150 μL 1x 洗涤缓冲液洗涤四次。
12. 在1x 洗涤缓冲液中按1：1000稀释检测抗体。
13. 向每孔中加入50 μL稀释后的检测抗体。
14. 覆盖并在室温孵育30分钟。
15. 将孔中的稀释后检测抗体吸走。
16. 用150 μL 1x 洗涤缓冲液洗涤五次。

检测方法

17. 向每孔中加入100 μL显影液。
18. 覆盖并在室温避光孵育1-10分钟。监测反应的颜色变化。溶液将会变成蓝色。
19. 向每孔中加入50 μL终止液。反应将会变为黄色。
20. 在读板仪上读取450 nm处的吸光值。
21. 计算相对的总体甲基化水平。

计算

在计算相对于甲基化对照DNA的甲基化水平时，可采用以下步骤。

单点法

相对于甲基化对照DNA的甲基化百分比

1. 将空白对照、样品和甲基化对照DNA的A450重复取平均值
   
   
2. 进行以下计算来获得样品相对于甲基化对照DNA的甲基化百分比
   
   [(A450 样品平均值 - A450 空白对照平均值)/(A450 甲基化对照DNA平均值 - A450 空白对照平均值)] x 100
   
   
3. 样品计算
   
   空白对照的A450平均值 = 0.090
   60 ng甲基化对照DNA的A450平均值 = 0.785
   60 ng样品DNA的A450平均值 = 0.654
   [(0.654 – 0.090) / (0.785 – 0.090] x 100 = 81.15%
   样品DNA相对于甲基化对照DNA的总体甲基化水平为81.15%

标准曲线法

来自甲基化对照DNA标准曲线的样品中甲基化DNA ng数

1. 通过采用
   （A450 甲基化对照DNA平均值 - A450 空白对照平均值）与甲基化对照DNA ng数进行作图以绘制标准曲线。
   参见样品曲线。
   
   
2. 使用线性回顾计算标准曲线的斜率
   
   
3. 按以下公式计算每个（A450 样品平均值 - A450 空白对照平均值）数值对应的甲基化DNA ng数：
   
   样品中甲基化DNA ng数 = [(A450 样品平均值 - A450 空白对照平均值) – 截距] / 斜率
   注：在绝大多数情况下，截距都是零。

故障排除

观测结果	原因	建议解决方案
空白对照中存在高背景（>0.2 OD）	不正确/不一致的洗涤	按实验方法所示进行所有的洗涤步骤。必要时，可在现有的洗涤步骤中加上额外一步洗涤。
	DNA污染	确保加入DNA结合液时使用的是干净的吸头。确保处理板时没有发生飞溅。
	过度显影	在加入显影液后立即对是否出现蓝色进行监测。不要让反应孵育超过十分钟。
含DNA的样品没有信号 （>0.2 OD）	试剂的加入	确保每种试剂都是按照正确的顺序加入且没有漏过任何步骤。
	洗涤	确保检测条上的孔没有在加入DNA样品前进行了洗涤。
	孵育时间和温度	确保使用了实验方案中的孵育时间和温度。
	DNA加入至孔中	确保DNA在加入前充分混匀。检测条上的孔可结合最高200 ng的总DNA。试剂盒中所包含的甲基化对照DNA（货号M8570）可在10 ng的水平被检测到。
	DNA降解	确保DNA储存在了合适的温度。

需要但未提供的材料和试剂

W4502

参考文献

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