胰蛋白酶抑制剂

• 胰蛋白酶抑制剂产品
• 细胞培养应用
• 胰蛋白酶抑制剂检测步骤

天然胰蛋白酶抑制剂也称为丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins），是最大和最多样化的蛋白酶抑制剂家族。¹Serpins在体外通过抑制体内丝氨酸蛋白酶来控制蛋白质的活化和分解代谢。²

有四种天然来源的胰蛋白酶抑制剂：牛胰腺、卵类粘蛋白、大豆和利马豆。每种抑制剂都作为竞争性底物类似物，与其丝氨酸蛋白酶结合形成无活性复合物，从而使蛋白酶失活。³

该过程允许丝氨酸蛋白酶抑制剂（胰蛋白酶抑制剂）在不再需要其功能时停止丝氨酸蛋白酶的蛋白水解活性。

胰蛋白酶抑制剂根据其来源提供独特的处理过程。例如，豆科植物（大豆和利马豆）种子中的抑制剂通过破坏中肠蛋白酶作为昆虫取食威慑物。在抗昆虫转基因植物的开发中正在扩展这种天然功能。目前人们还发现大豆抑制剂有助于大鼠的胰腺肥大，再次提供取食威慑作用。有关Bowman-Birk大豆抑制剂作为癌症预防药物的研究正在进行中。⁴ 

产品

图 1. T0256 - 来自牛胰腺的胰蛋白酶抑制剂

别名：BPTI（基础胰腺胰蛋白酶抑制剂）
分子量：~6.5 kDa（单链58个氨基酸肽）
pI：~10.5
比活性：1mg胰蛋白酶抑制剂可抑制超过1.5mg活性约为10,000 BAEE单位/mg蛋白质的胰蛋白酶
源自新西兰来源的胰腺
溶解性：该产品可溶于水（2 mg / ml）。

BPTI是58个氨基酸的单多肽链，具有3个二硫键。⁵

BPTI抑制牛和人胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶和纤溶酶。BPTI不抑制猪弹性蛋白酶。⁶

 

图 2. T9253 - 鸡蛋清蛋白（II-O型）胰蛋白酶抑制剂

别名：卵类粘蛋白
分子量：~28 kDa
pI：4.1⁷
比活性：1mg可抑制0.8-1.2mg活性约为10,000 BAEE单位/mg蛋白质的胰蛋白酶。可抑制≤0.3 mg活性约为40 BTEE单位/mg蛋白质的胰凝乳蛋白酶。
溶解性：该产品可溶于0.67 M磷酸盐缓冲液，pH 7.6（1 mg/ml）

鸡卵类粘蛋白是抑制牛胰蛋白酶的主要糖蛋白。它由186个氨基酸组成，排列在三个串联结构域中。⁸每个结构域含有三个二硫键、两个酪氨酸残基和一个活性位点。⁹卵类粘蛋白被描述为胰蛋白酶的单头抑制剂，意味着每个卵类粘蛋白分子与胰蛋白酶按1:1结合。⁷

本产品含有一些卵抑制剂。卵抑制剂是鸡蛋清的另一种蛋白酶抑制剂。 卵抑制剂具有至少5个结合位点，负责抑制牛胰蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶和猪弹性蛋白酶。¹⁰胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶各自含有2个结合位点，而最后一个位点结合弹性蛋白酶。¹¹卵类粘蛋白和卵抑制剂是鸡蛋清中的两种最丰富的蛋白酶抑制剂，含量分别为含有11％和1.5％。¹²

T2011 - 来自鸡蛋清的胰蛋白酶抑制剂

III-O型（不含卵抑制剂）
别名：卵类粘蛋白
分子量：~27 kDa
比活性：1 mg产品可抑制1.0-2.0 mg活性约为10,000 BAEE单位/mg蛋白质的胰蛋白酶
溶解性：该产品可溶于0.67 M磷酸盐缓冲液，pH 7.6（1 mg/ml）

该产品具有与上述产品T9253相同的特性，但通过硫酸铵切割和过滤方法进一步纯化，以消除卵抑制剂。不存在卵抑制剂可导致更纯的卵类粘蛋白，它继续抑制1:1复合物中的胰蛋白酶。

T4385 - 来自火鸡蛋清的胰蛋白酶抑制剂

II-T型
别名：火鸡卵类粘蛋白
分子量：~20 kDa
比活性：1 mg产品可抑制0.9-1.3 mg活性约为10,000 BAEE单位/mg蛋白质的胰蛋白酶，或者0.4-1.0mg活性约为40 BTEE单位/mg蛋白质的α-胰凝乳蛋白酶
溶解性该产品可溶于0.67 M磷酸盐缓冲液，pH 7.6（1 mg/ml）

来自火鸡蛋清的胰蛋白酶抑制剂含有两个独立的结合位点，一个用于牛胰蛋白酶，另一个用于α-胰凝乳蛋白酶。在低pH（2.0）时，第三个结构域（OMTKYT3）发展并抑制大多数喜欢中性复合位点的丝氨酸蛋白酶。¹³

Kunitz和Bowman-Birk（BBI）大豆蛋白酶抑制剂

这两种蛋白质是大豆中最丰富的蛋白酶抑制剂。分子量为8kDa的BBI是胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的强抑制剂，并且每个都含有独立的结合位点。分子量为20.1kDa的Kunitz抑制剂包含一个结合位点，其强烈抑制胰蛋白酶，同时弱结合胰凝乳蛋白酶。

图 3. 来自大豆（Glycine max）的胰蛋白酶抑制剂：Kunitz抑制剂

别名：Kunitz胰蛋白酶抑制剂、Tia1、STI和SBTI
分子量：20.1 kDa
pI：4.5²⁵
消光系数：E1％= 9.94
（280 nm，pH 7.6缓冲液）

大豆胰蛋白酶抑制剂首先由Kunitz分离。¹⁴ 大豆中也发现了其他几种相关的抑制剂。¹⁵大豆胰蛋白酶抑制剂是一种单链蛋白，在一条多肽链中含有181个氨基酸残基，由两个二硫桥交联。^16-18

大豆胰蛋白酶抑制剂抑制胰蛋白酶，并且在较小程度上抑制胰凝乳蛋白酶¹⁹和纤溶酶。²⁰大豆胰蛋白酶抑制剂还通过类似于胰蛋白酶的机制抑制其他蛋白酶。SBTI对血浆激肽释放酶和凝血因子Xa具有抑制作用。然而，大豆胰蛋白酶抑制剂不会抑制金属蛋白酶、基于组织的激肽释放酶、酸性蛋白酶或硫代蛋白酶。

大豆胰蛋白酶抑制剂与蛋白酶活性位点形成1:1的化学计量复合物。在形成这种复合物后，胰蛋白酶可以在抑制剂上切割单个精氨酸 - 异亮氨酸键。^21,22抑制作用是可逆的和pH依赖性的。该复合物的解离可以产生抑制剂的修饰形式或天然形式。²³胰蛋白酶结合的最佳pH为8.0，在pH8.0时结合常数大于10⁹，在pH3.6-4.4时结合常数为0.15-2.6×10⁴。²⁴

T9003 - 来自大豆（Glycine max）的胰蛋白酶抑制剂
I-S型
该产品在DEAE Sepharose上进行色谱纯化，含有10％磷酸钠缓冲盐，pH 7.6。
比活性：1mg可抑制1.0-3.0 mg活性约为10,000 BAEE单位/mg蛋白质的胰蛋白酶。
在pH 7.8、25℃下,一单位胰凝乳蛋白酶每分钟水解1.0μmole的BTEE。
溶解性：胰蛋白酶抑制剂可以10 mg/mL溶于水和磷酸盐缓冲液。它可溶于平衡盐溶液（1 mg/ml）和无血清培养基中。浓度高于10mg/ml的溶液可能会混浊，并且呈黄色至琥珀色。
储存方法/稳定性：该产品在-20°C冷冻等分试样中保持活性，但应避免冻融。该蛋白被短时间加热至80°C时会可逆地变性，加热至90°C会不可逆地变性。¹⁵

T6522 - 来自大豆（Glycine max）的胰蛋白酶抑制剂
I-S型
经细胞培养检验
该产品在DEAE Sepharose上进行色谱纯化，含有10％磷酸钠缓冲盐，pH 7.6。
比活性：1mg可抑制1-3 mg活性约为10,000 BAEE单位/mg蛋白质的胰蛋白酶
溶解性：胰蛋白酶抑制剂可以10 mg/mL溶于水和磷酸盐缓冲液。它可以1 mg/mL溶于平衡盐溶液，也可溶于无血清培养基。浓度高于10 mg/ml的溶液可能会混浊，并且呈黄色至琥珀色。
储存方法/稳定性：该产品在-20°C冷冻等分试样中保持活性，但应避免冻融。该蛋白被短时间加热至80°C时会可逆地变性，加热至90°C会不可逆地变性。¹⁵

T6414 - 来自大豆（Glycine max）的胰蛋白酶抑制剂
该产品是无菌过滤的细胞培养的1x溶液（Dulbecco PBS中的0.1％胰蛋白酶抑制剂溶液），适用于细胞培养应用。它已针对内皮细胞传代进行了优化。
储存方法/稳定性：该产品在-20°C冷冻等分试样中保持活性，但应避免冻融。该蛋白被短时间加热至80°C时会可逆地变性，加热至90°C会不可逆地变性。¹⁵

T9008 - 来自大豆（Glycine max）的胰蛋白酶抑制剂的1％水溶液
用于细胞培养应用
从 T9003 制备，无菌过滤并处理，得到方便使用的不含缓冲液的溶液。
储存方法/稳定性：本产品储存于2-8°C。该溶液也可以在-20℃下以冷冻等分试样储存，但应避免冻融循环。该蛋白被短时间加热至80°C时会可逆地变性，加热至90°C会不可逆地变性。¹⁵

TT9128 - 来自大豆（Glycine max）的胰蛋白酶抑制剂 
II-S型
通过硫酸铵分级分离以及一系列澄清步骤制备，得到含有90％蛋白质和10％磷酸钠缓冲盐（pH 7.6）的产物。
比活性：1mg最少可抑制1.0 mg活性约为10,000 BAEE单位/mg蛋白质的胰蛋白酶。
溶解性：该产品可溶于水（1 mg / ml）。较高浓度（大于10 mg/ml）的溶液可能会模糊，并且呈黄色至琥珀色。
储存方法/稳定性：该产品在-20°C冷冻等分试样中保持活性，但应避免冻融。该蛋白被短时间加热至80°C时会可逆地变性，加热至90°C会不可逆地变性。¹⁵

T2327 - 来自大豆（Glycine Max）的胰蛋白酶抑制剂
≥98% Kunitz型抑制剂
从 T9128 进一步色谱纯化，得到纯Kunitz型胰蛋白酶抑制剂。
该产品含有10％磷酸钠缓冲盐，pH 7.6。
比活性：1mg可抑制≥ 1.6 mg 活性约为10,000 BAEE单位/mg蛋白质的胰蛋白酶。
溶解性：胰蛋白酶抑制剂可溶于水以及磷酸盐缓冲液中，当浓度高于10 mg/ml时可能会模糊，呈黄色至琥珀色。
储存方法/稳定性：该产品在-20 °C冷冻等分试样中保持活性，但应避免冻融。该蛋白被短时间加热至80 °C时会可逆地变性，加热至90°C会不可逆地变性。¹⁵

来自大豆（Glycine max）的胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂：Bowman-Birk抑制剂

图 4. T9777 - 来自大豆（Glycine max）的胰蛋白酶 - 胰凝乳蛋白酶抑制剂

别名：Bowman-Birk抑制剂（BBI）
CAS号：37330-34-0
单位定义：一单位胰蛋白酶每分钟将产生0.001的ΔA₂₅₃，BAEE作为底物，pH值为7.6，温度为25℃；反应体积为3.2 ml，光程1 cm。
分子量：8 kDa²⁹

来自大豆的Bowman-Birk抑制剂（BBI），是由7个二硫桥交联的单个多肽链中含有71个氨基酸的单体蛋白。²⁶该抑制剂含有两个独立的抑制结合位点，一个用于胰蛋白酶，另一个用于胰凝乳蛋白酶。²⁷BBI结合每种蛋白酶形成1:1复合物。由于抑制是非竞争性的，BBI具有与两种酶形成三元复合物的能力。²⁸

该产品在DEAE Sepharose上进行色谱纯化，含有20％磷酸钠缓冲盐，pH 7.6。
比活性：1mg可抑制≥ 0.5 mg 活性约为10,000 BAEE单位/mg蛋白质胰蛋白酶。
1mg可抑制≥ 1.0 mg 活性约为40 BTEE单位/mg蛋白质的胰凝乳蛋白酶。
溶解性：胰蛋白酶 - 胰凝乳蛋白酶抑制剂可溶于水或0.67M磷酸钠，pH 7.6（1mg/ml）。

来自利马豆（Phaseolus limensis）的胰蛋白酶抑制剂：

别名：来自利马豆和LBTI 的胰蛋白酶抑制剂
分子量：9 kDa
pI：4.5²⁵
消光系数：E1％= 9.94
（280 nm，pH 7.6缓冲液）

来自利马豆的胰蛋白酶抑制剂是由83个氨基酸组成的单体，其具有经历浓度依赖性二聚化的能力。自缔合的程度取决于变体的类型和pH值。³⁰

来自利马豆（Phaseolus limensis）的胰蛋白酶抑制剂具有4-6种变体，其对胰蛋白酶的抑制活性基本相同；然而，在抑制胰凝乳蛋白酶方面存在一些差异。变体的氨基酸序列相似，每个含有7个二硫键。³¹

胰蛋白酶抑制剂与蛋白酶活性位点形成1:1的化学计量复合物。抑制剂与胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的复合物对更多相同的酶没有进一步的抑制作用，但对另一种酶具有完全活性（形成1:1:1复合物）。^30,32这意味着有一个结合胰蛋白酶的位点以及另一个结合胰凝乳蛋白酶的位点。胰蛋白酶结合Lys-Ser位点，而胰凝乳蛋白酶结合Leu-Ser位点。³¹抑制作用是可逆的和pH依赖性的。该复合物的解离可以产生抑制剂的修饰形式或天然形式。²³胰蛋白酶结合的最佳pH为8.0，在pH8.0时结合常数大于10⁹，在pH3.6-4.4时结合常数为0.15-2.6×10⁴。²⁴

T9378 - 来自利马豆（Phaseolus limensis）的胰蛋白酶抑制剂
该产品是含有10％磷酸钠缓冲盐、pH 7.6的冻干粉末。
比活性：1mg最少可抑制0.8 mg活性约为10,000 BAEE单位/mg蛋白质的胰蛋白酶。
溶解性：胰蛋白酶抑制剂可以1 mg/mL溶于水和磷酸盐缓冲液。它可溶于平衡盐溶液和无血清培养基中。浓度高于10 mg/ml的溶液可能会混浊，并且呈黄色至琥珀色。

细胞培养应用

胰蛋白酶抑制剂用于细胞培养应用中，以在细胞解离期间进一步抑制胰蛋白酶活性，以防止细胞损伤/死亡。

操作流程：
胰蛋白酶消化细胞后，对每ml用于解离的胰蛋白酶溶液，将细胞重悬于1 ml胰蛋白酶抑制剂溶液（1 mg/ml，使用平衡盐溶液或无血清培养基）中。将细胞悬浮液以1000 rpm离心5分钟。应该形成细胞沉淀。尽可能充分去除胰蛋白酶抑制剂，并将沉淀重悬于无血清培养基中。根据需要培养细胞。

胰蛋白酶抑制剂活性的测定方法

大多数Sigma胰蛋白酶抑制剂的活性通过连续速率分光光度测定法测定，并表示为BAEE单位的抑制。

单位定义：一BAEE单位每分钟将产生0.001的ΔA253，BAEE作为底物，pH值为7.6，温度为25℃。反应体积为3.2 ml。

条件
温度 = 25 ℃，pH = 7.6，A253 nm，光程 = 1 cm
在3.2 ml反应混合物中，最终浓度为63 mM磷酸钠，0.23 mM Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯（BAEE），0.002 mM盐酸，0.005 mg胰蛋白酶和0.003-0.001 mg胰蛋白酶抑制剂。

所需试剂
S0751 - 磷酸二氢钠，一元
B4500 - Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐（BAEE)
258148 - 盐酸ACS试剂
T8003 - 来自牛胰腺的胰蛋白酶

试剂

1. 67 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.6，25 °C
   （使用磷酸钠（一元，无水，货号 S0751）在去离子水中制备100 ml。在25 ℃下用1 M NaOH调节至pH 7.6。）
2. 0.25 mM Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯溶液（BAEE）
   （使用 Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯，盐酸盐（货号 B4500）在试剂a中制备50 ml。）
3. 1 mM盐酸溶液（HCl）
   （使用浓 盐酸（货号 258148）在去离子水中制备50 ml。）
4. 胰蛋白酶酶溶液（胰蛋白酶）
   （在使用前，立即在冷的试剂C中制备每ml 胰蛋白酶（货号 T8003）中含有1 mg 蛋白质的溶液。）
5. 胰蛋白酶抑制剂溶液（抑制剂）
   （在使用前，立即在冷的试剂A中制备含有1.0 mg/ml胰蛋白酶抑制剂的溶液。）

操作流程
移取（以毫升计）以下试剂到合适的石英比色皿中

A部分：

	Uninh	试样1	试样2	试样3	试样4	试样5
试剂e（抑制剂）	—	0.10	0.15	0.20	0.25	0.30
试剂d（胰蛋白酶）	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
试剂c（HCl）	9.50	9.40	9.35	9.30	9.25	9.20

在25 °C下静置至少5分钟，不超过6分钟。

通过倒置和吹吸（以毫升计），将以下试剂混合到合适的比色皿中：

B部分：

	Uninh	试样1	试样2	试样3	试样4	试样5	空白样
试剂b（BAEE）	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
试剂c（HCl）	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.20

通过倒置混合并平衡至25 ℃。使用适当恒温的分光光度计监测A_253nm直至恒定。然后添加：

Uninh（A部分）	0.10	—	—	—	—	—	—
试样1（A部分）	—	0.10	—	—	—	—	—
试样2（A部分）	—	—	0.10	—	—	—	—
试样3（A部分）	—	—	—	0.10	—	—	—
试样4（A部分）	—	—	—	—	0.10	—	—
试样5（A部分）	—	—	—	—	—	0.10	—

立即倒置混合，并记录约5分钟内的_253nm增量。使用最大线性速率，分别获取试样、空白样和不受抑制的溶液的ΔA_253nm/min值。

计算

BAEE单位/ml酶中的胰蛋白酶活性 =

(ΔA253nm/min试样 – ΔA253nm/min空白样)(df)(10.0) (0.001)(0.10)(0.5)

df =稀释因子
0.001 = 在pH 7.6、25 ℃下，3.2 ml反应混合物中每单位胰蛋白酶A253nm /分钟的变化
0.10 = 所使用的酶的体积（以毫升计）（B部分）
10.0 = 以毫升测定的总体积（部分A）
0.5 = 所使用的酶的体积（以毫升计）（A部分）

单位/mg固体 =

单位/ml酶 mg固体/ml酶

绘制胰蛋白酶活性（BAEE单位/mg蛋白质）对ml胰蛋白酶抑制剂/RM的关系图。
胰蛋白酶抑制剂mg =（胰蛋白酶抑制剂ml）胰蛋白酶抑制剂浓度，mg/ml）

1 mg胰蛋白酶抑制剂可抑制的胰蛋白酶mg =

胰蛋白酶mg / RM（标准化因子） 胰蛋白酶抑制剂mg（来自图）

标准化因子=（每mg固体的未受抑制的胰蛋白酶的BAEE单位/每个规格的10,000个BAEE单位的胰蛋白酶。）

说明：

1. 该酶测定法用于测定货号：  T9003、T9008、T9128、T9253、T2011、T4385、T9378和T0256。
2. 当测定II-S型胰蛋白酶抑制剂（货号：T9128）时，在冷的试剂a中制备含有0.60 mg/ml胰蛋白酶抑制剂的溶液。
3. 未受抑制的胰蛋白酶活性应在活性释放值的85％以内。
4. 每个标签含有11,700至13,005个胰蛋白酶单位/mg固体，未受抑制的胰蛋白酶反应活性的可接受范围应为10,000至15,300胰蛋白酶单位/mg固体。该范围还应对应于校正的0.0545至0.0835的ΔAbs_253nm/min。利用该速率和20％至80％的抑制，ΔAbs_253nm/min应高于分光光度计速率检测限0.0020。

胰蛋白酶单位换算
1 BAEE µM 单位 = 200 BAEE 单位
1 TAME µM 单位 = 0.27 BAEE µM 单位
1 BAEE µM 单位 = 3.64 TAME 单位
1 TAME µM 单位 = 55 BAEE A253 单位
1 BAEE A253 单位 = 0.018 TAME µM 单位
1 TAME µM 单位 = 180 TAME A247 单位
1 TAME A247 单位 = 0.33 BAEE 单位
1 USP 单位 = 3.0 BAEE 单位
1 NF 单位 = 1.1 USP 单位

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