Lisis y extracción de proteínas

Se dispone de numerosos métodos para romper las células y preparar su contenido para el análisis. En general, se emplean métodos suaves cuando la muestra consiste en células cultivadas fácilmente lisadas o células sanguíneas, mientras que se utilizan métodos más vigorosos para la ruptura de células vegetales o bacterianas más robustas, o de células de mamífero incluidas en tejido conjuntivo.

• Lisis con detergente: Lisis con detergente: La lisis con detergente es un método suave que puede utilizarse para las células de mamíferos, las células bacterianas, las levaduras y las plantas. Las suspensiones celulares se centrifugan suavemente y se vuelven a suspender en una disolución de lisis con detergentes que actúan rompiendo la membrana celular. Las membranas se solubilizan, lisando las células y liberando su contenido. Es posible que sea necesario retirar los detergentes más adelante si interfieren en el análisis o la producción.
• Lisis por congelación-descongelación: Este método es aplicable a las suspensiones de células de mamífero o células bacterianas. La suspensión celular se congela rápidamente utilizando nitrógeno líquido. La muestra se descongela después y se vuelve a suspender mediante pipeteo o agitación suave en tampón de lisis, repitiendo el proceso varias veces. Entre los ciclos la muestra se centrífuga y el sobrenadante que contiene la proteína soluble se conserva.
• Choque osmótico: Éste es un método muy suave que puede ser suficiente para la lisis de células bacterianas o de mamífero suspendidas sin la utilización de un detergente. El método, a menudo combinado con la ruptura mecánica, se basa en modificar la osmolaridad del medio, de muy osmótico a poco osmótico, y es idóneo para aplicaciones en las cuales el lisado va a fraccionarse posteriormente en los componentes subcelulares.
• Ultrasonidos: Este método de extracción de proteínas se aplica más a menudo a las suspensiones celulares. Las células se rompen mediante ondas sonoras de alta frecuencia a través de una sonda insertada en la muestra. Las ondas sonoras generan una región de baja presión, lo que causa la ruptura de las membranas celulares.
• Métodos mecánicos: Las proteínas pueden extraerse de las células y los tejidos utilizando varias medidas toscas pero eficaces de «trituración y molienda». Por ejemplo, las membranas celulares pueden romperse por fuerzas mecánicas líquidas utilizando homogeneización Dounce o Potter-Elvehjem Los tejidos pueden ser homogeneizados cortándolos o picándolos en una disolución tampón fría utilizando un mezclador Waring o un homogeneizador Polytron®. Los tejidos o las células pueden congelarse en nitrógeno líquido y molerse hasta un polvo fino utilizando un mortero y un almirez con alúmina o arena. La agitación rápida de las células con microesferas de vidrio finas rompe las paredes celulares. Esto es eficaz para la mayoría de las bacterias gramnegativas y grampositivas.
• Digestión enzimática: Digestión enzimática: Los métodos enzimáticos se utilizan a menudo cuando se quieren extraer proteínas de bacterias, levaduras o células eucariotas incluidas en tejidos fibrosos donde las membranas celulares están rodeadas por una estructura protectora robusta. Las enzimas de lisis celular, o cócteles como Lysozyme, Mutanolysin, MetaPolyzyme, Lysonase y Pronase, pueden utilizarse en combinación con enzimas de digestión tisular (colagenasa, condroitinasa, hialuronidasa) para disolver o desorganizar las paredes celulares, los revestimientos, las cápsulas, las cápsides u otras estructuras que no se rompen con facilidad sólo por medios mecánicos. La digestión enzimática puede ir seguida de homogenización, tratamiento con ultrasonidos o agitación vigorosa en Vórtex en un tampón para lisis.

Además, dado que tras la ruptura celular pueden liberarse proteasas y fosfatasas endógenas y degradar la molécula diana, la muestra debe protegerse durante la ruptura celular y la subsiguiente purificación utilizando inhibidores de proteasas y de fosfatasas para evitar la pérdida incontrolada de la diana.