Secuenciación

Secuenciación de Sanger

Al principio, la composición de los ácidos nucleicos pudo determinarse utilizando métodos de química analítica. Sin embargo, empleando inicialmente fragmentos radiomarcados digeridos y fraccionamiento bidimensional, Fred Sanger y sus colegas desarrollaron métodos que permitieron proporcionar algunas de las primeras secuencias nucleicas completas. Los avances en el campo continuaron durante décadas y cada mejora se fue sumando a una creciente colección de de proteínas y genomas secuenciados. Una de esas mejoras fue la separación de nucleótidos por longitud utilizando electroforesis en gel seguida de electroforesis capilar. Además, la incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia y el análisis automatizado por ordenador de cada fragmento de ácido nucleico definen ahora el método moderno de secuenciación de Sanger.

Metodología de secuenciación del ADN

Si bien los métodos para secuenciar el ADN han seguido mejorando desde el origen de esta tecnología, siguen siendo necesarios varios componentes fundamentales, que se utilizan en las plataformas modernas de secuenciación del ADN. La preparación del ADN consiste normalmente en el aislamiento y la purificación del ADN del organismo anfitrión. Se añaden a un único recipiente otros componentes fundamentales, como bases de ADN libres, cebadores de ADN, bases de ADN modificadas que contienen etiquetas fluorescentes (bases terminadoras) y ADN polimerasa. El recipiente que contiene todos estos componentes producirá a través de una serie de etapas de calentamiento y enfriamiento una colección de secuencias de ADN pequeñas con respecto a la secuencia de ADN de longitud completa de interés, cada una de las cuales terminará con una base de terminación marcada con fluorescencia. Las nuevas hebras de ADN que contienen los nucleótidos terminalmente marcados con fluorescencia se separan por longitud, se hacen pasar a través de un tubo capilar y se organizan por tamaño. A continuación, se utiliza un láser para excitar la base fluorescente en cada hebra mientras una cámara capta la señal. Por último, suele utilizarse un ordenador para reunir la información recogida en la secuencia de ADN completa.