Podstawy hodowli komórek: Kriokonserwacja i przechowywanie linii komórkowych

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

Kriokonserwacja linii komórkowych

Celem kriokonserwacji, czyli zamrażania komórek, jest umożliwienie przechowywania zapasów komórek, aby zapobiec potrzebie posiadania wszystkich linii komórkowych.nbsp;
linie komórkowe w hodowli przez cały czas. Jest to nieocenione w przypadku komórek o ograniczonej żywotności. Inne główne zalety kriokonserwacji to:

• Zmniejszone ryzyko skażenia mikrobiologicznego
• Zmniejszone ryzyko skażenia krzyżowego z innymi liniami komórkowymi
• Zmniejszone ryzyko dryfu genetycznego i zmian morfologicznych
• Praca prowadzona przy użyciu komórek o stałym numerze pasażowania
• (patrz rozdział 8 "Dobre praktyki w hodowli komórek").(patrz sekcja 8 "Dobre praktyki bankowości komórkowej")
• Obniżone koszty (materiały eksploatacyjne i czas personelu)

Podjęto wiele prac rozwojowych w celu zapewnienia skutecznej kriokonserwacji i reanimacji szerokiej gamy linii komórkowych różnych typów komórek. Podstawową zasadą skutecznej kriokonserwacji i resuscytacji jest powolne zamrażanie i szybkie rozmrażanie. Chociaż wymagania mogą się różnić w zależności od linii komórkowych, jako ogólny przewodnik komórki powinny być schładzane w tempie od -1°C do -3°C na minutę i szybko rozmrażane poprzez inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 3-5 minut. Jeśli to i dodatkowe punkty podane poniżej są przestrzegane, większość linii komórkowych powinna być pomyślnie kriokonserwowana.

1. Kultury powinny być zdrowe z żywotnością >90% i bez oznak zanieczyszczenia mikrobiologicznego.
2. Kultury powinny znajdować się w fazie logarytmicznego wzrostu (można to osiągnąć stosując wstępnie przepełnione kultury, które są poniżej maksymalnej gęstości komórek i zmieniając podłoże hodowlane 24 godziny przed zamrożeniem).
3. Należy stosować wysokie stężenie surowicy/białka (20%). W wielu przypadkach surowica jest stosowana w stężeniu 90%.
4. Używaj krioprotektantów takich jak dimetylosulfotlenek (DMSO). lub glicerol aby pomóc chronić komórki przed pęknięciem w wyniku tworzenia się kryształków lodu. Najczęściej stosowanym krioprotektantem jest DMSO w końcowym stężeniu 10%. Nie jest to jednak odpowiednie dla wszystkich linii komórkowych, na przykład gdy DMSO jest używane do indukowania różnicowania. W takich przypadkach należy użyć alternatywy, takiej jak glicerol (szczegółowe informacje na temat właściwego krioprotektantu można znaleźć w arkuszu danych ECACC). Oferujemy gotowe środki do zamrażania komórek zawierające DMSO, glicerol i preparaty bez surowicy zawierające DMSO.
5. Powolne zamrażanie, obniżanie temperatury o około 1°C na minutę, przy użyciu pojemnika do zamrażania Nalgene Mr. Frosty Freezing Container lub Corning Cool Cell Freezing Container może pomóc w skutecznej kriokonserwacji komórek.

Rysunek 1. Mechanizm kriokonserwacji komórek. Krioprotektanty, takie jak DMSO lub glicerol, mogą być dodawane do pożywek do hodowli komórkowych jako krioprotektanty dla komórek. DMSO zmniejsza tworzenie się kryształów lodu, a tym samym zapobiega śmierci komórek podczas procesu zamrażania. Około 10% v/v może być stosowane w metodzie powolnego zamrażania (obniżanie temperatury o około 1°C na minutę), a komórki mogą być zamrażane w temperaturze -80°C (-112°F) lub przechowywane w ciekłym azocie przez dłuższy czas.

Przechowywanie linii komórkowych w ultraniskich temperaturach

Po kontrolowanym zamrożeniu w obecności krioprotektantów, linie komórkowe mogą być kriokonserwowane w stanie zawieszenia przez nieokreślony czas, pod warunkiem utrzymania temperatury poniżej -135°C. Tak bardzo niskie temperatury można osiągnąć jedynie za pomocą specjalistycznych zamrażarek elektrycznych lub, co bardziej typowe, poprzez zanurzenie w ciekłym azocie lub azocie w fazie lotnej. Zalety i wady można podsumować następująco:

Metoda	Zalety	Cechy
	Wady
Zamrażarka elektryczna (-135 °C)	Łatwość konserwacji Stała temperatura Niskie koszty eksploatacji	Wymaga zasilania ciekłym azotem Złożone mechanicznie Wysokie temperatury przechowywania w stosunku do ciekłego azotu
Ciekły azot w fazie ciekłej	Stała, bardzo niska (-196°C) temperatura Prostota i niezawodność mechaniczna	Wymaga regularnych dostaw ciekłego azotu Wysokie koszty eksploatacji Ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego przez ciekły azot
Azot w fazie lotnej	Brak ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego ciekłym azotem Osiągane niskie temperatury Prostota i niezawodność	Wymaga regularnych dostaw ciekłego azotu Wysokie koszty eksploatacji Wahania temperatury od -135 °C do -190 °C

Przechowywanie w ciekłym azocie pozwala na utrzymanie najniższej możliwej temperatury przechowywania przy zachowaniu absolutnej spójności, ale wymaga użycia dużych objętości (głębokości) ciekłego azotu, co stanowi potencjalne zagrożenie. Istnieją również udokumentowane przypadki zanieczyszczenia krzyżowego patogenami wirusowymi za pośrednictwem ciekłego azotu. Z tych powodów przechowywanie w ultraniskich temperaturach odbywa się najczęściej w azocie w fazie lotnej.

W przypadku przechowywania w azocie w fazie lotnej ampułki są umieszczane nad płytkim zbiornikiem ciekłego azotu, którego głębokość musi być starannie utrzymywana. W fazie gazowej występuje pionowy gradient temperatury, którego skrajne wartości zależą od utrzymywanego poziomu cieczy, konstrukcji zbiornika i częstotliwości jego otwierania. Wahania temperatury w górnych obszarach zbiornika do przechowywania w fazie gazowej mogą być ekstremalne, jeśli nie jest przeprowadzana regularna konserwacja. Nowoczesne konstrukcje zbiorników do przechowywania ciekłego azotu coraz częściej oferują ulepszoną technologię przechowywania w fazie lotnej.

Utrata całych zapasów komórek z powodu nieodpowiedniej konserwacji przechowywania jest niepokojąco powszechna. Wszystkie zbiorniki do przechowywania ciekłego azotu powinny być wyposażone w alarmy ostrzegające o niskim poziomie ciekłego azotu, a także powinny być stale monitorowane i alarmowane. Dotyczy to w szczególności systemów przechowywania w fazie lotnej. Zbiornik do przechowywania ciekłego azotu luzem nie powinien być napełniony mniej niż do połowy przed ponownym napełnieniem. Zapewni to, że co najmniej jedna dostawa ciekłego azotu może zostać pominięta bez katastrofalnych konsekwencji. Zaleca się, aby cenne zapasy komórek były przechowywane w drugiej lokalizacji. ECACC oferuje w tym celu usługę bezpiecznego depozytu.

Rysunek 2. Typowe zbiorniki do przechowywania ciekłego azotu używane do kriokonserwacji komórek.

Kontrola inwentaryzacji linii komórkowej

Wszystkie zbiorniki do przechowywania w bardzo niskich temperaturach powinny obejmować system regałów / inwentaryzacji zaprojektowany w celu uporządkowania zawartości, aby ułatwić lokalizację i pobieranie zamrożonych fiolek Powinno to być wspierane przez dokładne prowadzenie dokumentacji i kontrolę inwentaryzacji obejmującą następujące elementy:

• Każda ampułka powinna być indywidualnie oznakowana, przy użyciu etykiet odpornych na ciekły azot z identyfikacją, numerem partii, numerem przejścia i datą zamrożenia.
• Lokalizacja każdej ampułki powinna być rejestrowana, najlepiej w elektronicznej bazie danych lub arkuszu kalkulacyjnym, ale także w papierowym planie przechowywania.
• Powinien istnieć system kontroli zapewniający, że żadna ampułka nie może zostać zdeponowana lub wycofana bez aktualizacji zapisów.

Uwagi dotyczące bezpieczeństwa ciekłego azotu

Ogólne kwestie bezpieczeństwa

Ważne jest, aby personel został przeszkolony w zakresie korzystania z ciekłego azotu i związanego z nim sprzętu, w tym zbiorników do przechowywania, które muszą być bezpiecznie odpowietrzane, oraz pojemników, które mogą wymagać napełnienia. Podobnie jak w przypadku wszystkich procedur laboratoryjnych, podczas pracy z azotem należy zawsze nosić osobiste wyposażenie ochronne, w tym przyłbicę na całą twarz i izolowane termicznie rękawice, a także fartuch laboratoryjny i najlepiej odporny na zachlapanie plastikowy fartuch. Odpowiednie przeszkolenie i stosowanie sprzętu ochronnego zminimalizuje ryzyko odmrożeń, oparzeń i innych niepożądanych zdarzeń.

Ryzyko uduszenia

Najważniejszym aspektem bezpieczeństwa jest potencjalne ryzyko uduszenia, gdy ulatniający się azot odparowuje i wypiera tlen atmosferyczny. Ma to krytyczne znaczenie, ponieważ niedobór tlenu może bardzo szybko spowodować utratę przytomności bez ostrzeżenia. W związku z tym chłodziarki na ciekły azot powinny być umieszczane w dobrze wentylowanych miejscach, aby zminimalizować to ryzyko i podlegać planowanej konserwacji zapobiegawczej. Duże magazyny powinny być wyposażone w systemy alarmowe niskiego poziomu tlenu.

Środki ostrożności dla dedykowanych obszarów przechowywania ciekłego azotu

• Używaj alarmów tlenowych ustawionych na 18% tlenu (v/v)
• Szkolenie personelu - personel powinien zostać przeszkolony, aby ewakuować się z obszaru natychmiast po usłyszeniu alarmu i nie wracać, dopóki poziom tlenu nie powróci do normalnego poziomu (~ 20% v/v)
• Podczas pracy z ciekłym azotem należy pracować w parach
• Zakaz używania azotu poza normalnymi godzinami pracy./li>
• Personel powinien pracować w parach podczas pracy z ciekłym azotem
• Zakaz używania azotu poza normalnymi godzinami pracy
• Mechaniczne systemy wentylacyjne powinny być zainstalowane, jeśli to możliwe