Wskazówki dotyczące testu migracji i inwazji komórek przy użyciu wkładów do hodowli komórkowych Millicell^®

• Przegląd testu migracji i inwazji
• Co jest potrzebne do przeprowadzenia testu migracji/inwazji komórek?
• Wybór odpowiedniego rozmiaru porów dla testu migracji/inwazji komórek
• Optymalizacje testu migracji i inwazji
• Protokół próbki testu migracji i inwazji
• Dane próbki testu migracji i inwazji
• Porady i wskazówki dotyczące testu migracji i inwazji
• Tabela produktów
• Referencje

Przegląd testów migracji i inwazji

Migracja komórek to ukierunkowany ruch komórek w odpowiedzi na bodziec chemiczny (np. chemoatraktant) lub mechaniczny. Jest to ważna właściwość komórek, krytyczna dla ich rozwoju i normalnych procesów, takich jak gojenie się ran. Jednak jest również zaangażowany w stany chorobowe, takie jak zapalenie lub migracja i inwazja komórek nowotworowych.¹ Testy migracji i inwazji od dawna są wykorzystywane w biologii komórkowej do badania przerzutów nowotworowych, przy czym najpopularniejsze testy oparte są na systemie testowym Boydena. System ten został po raz pierwszy użyty w 1962 r. przez dr Boydena, który zademonstrował zastosowanie porowatej membrany Millipore^® do chemotaksji.²

Dziś testy migracji mogą być przeprowadzane przy użyciu wkładek do hodowli komórkowych Millicell^® hanging opartych na tym systemie testów Boydena, podczas gdy testy inwazji wymagają pokrycia membrany żelem ECM, takim jak Matrigel^®, a następnie posiania na niej komórek. Powłoka ta działa jak bariera dla komórek, przez którą mogą one przenikać podczas inwazji. Dostępne są wkładki o różnych rozmiarach porów, w zależności od wielkości komórek, które mają być użyte.

System komory Boydena wykorzystuje wydrążoną plastikową komorę i jest uszczelniony na jednym końcu porowatą membraną. Komora ta jest następnie zawieszana nad większą studzienką, która może zawierać pożywkę i/lub chemoatraktanty. Komórki są płukane w pożywce bez surowicy, aby zapewnić usunięcie całej surowicy przed dodaniem ich do wierzchołkowej (górnej) strony membrany we wkładkach. Podłoże zawierające odpowiedni chemoatraktant (np, Płodowa surowica bydlęca, różne cytokiny itp.) jest dodawana do studzienek poniżej wkładek (wraz z kontrolą negatywną, w której w pożywce nie ma chemoatraktantu), a komórki pozostawia się w inkubatorze 37°C CO₂ na żądany czas.

Po tej inkubacji niemigrujące komórki są delikatnie usuwane z wierzchołkowej strony membrany, a migrujące komórki po podstawno-bocznej stronie membrany można określić ilościowo za pomocą barwienia i obrazowania komórek.

Rysunek 1. Zasada testu inwazji. Komórki są wysiewane we wkładkach pokrytych ECM po wierzchołkowej stronie membrany, podczas gdy pożywka zawierająca odpowiedni chemoatraktant jest dodawana do płytki hodowli komórkowej. Płytki pozostawia się na wymagany czas (np. 24 godziny), aby umożliwić inwazję komórek na podstawno-boczną stronę membrany. Nieinwazyjne komórki są usuwane za pomocą bawełnianego wacika, a inwazyjne komórki są utrwalane i barwione przed obrazowaniem i zliczaniem. W przypadku testów migracji wystarczy pominąć etap powlekania ECM.

Co jest potrzebne do przeprowadzenia testu migracji/inwazji?

• Millicell^® Wkładki do hodowli komórkowych (patrz wybór wkładek poniżej)
• Matryca zewnątrzkomórkowa (np.g. Corning^® Matrigel^® Basement Membrane Matrix)
• Płytki do hodowli tkankowych
• Linie komórkowe
• Podłoża do hodowli komórkowych
• Chemoatraktant (np.g., Fetal Bovine Serum)
• Roztwór utrwalający (np. 70% etanol lub 4% paraformaldehyd)
• Sterylne kleszcze
• Waciki
• Roztwór konserwujący (np, Fiolet krystaliczny lub DAPI)
• Jałowa woda

Wybór odpowiedniego rozmiaru porów dla testu migracji/inwazji komórek

Rozmiar porów płytki zależy od rodzaju komórek, które mają być wykorzystane w teście. Ważne jest, aby zbyt duży rozmiar porów nie był używany dla mniejszych typów komórek, ale pory nie mogą być tak małe, że komórki migrujące nie mogą się przez nie zmieścić nawet w obecności chemoatraktantu. Tabela 1 przedstawia zalecenia dotyczące wielkości porów membrany dla wybranych typów komórek migrujących i inwazyjnych w oparciu o literaturę. 

Tabela 1. Rozmiar porów membrany wkładki do hodowli komórkowej i testy towarzyszące.

Zastosowanie	Typ komórki	Rozmiar porów (µm)/b>	Rozmiar porów (µm)
Migracja Migracja komórek metodą chemotaksji Migracja komórek metodą haptotaksji Test w komorze Boydena	Komórki śródbłonka3-4,8, HUVEC6-7, HMVEC5-6	3.0, 8.0
	Neutrofile9-12, PMNs12	3.0
	Limfocyty9,13, makrofagi14-15, monocyty16-17	3.0, 5.0
	.Komórki neuronalne18,19	3.0
	.Komórki dendrytyczne17,20-22	3.0, 5.0, 8.0
	Fibroblasty nabłonkowe23-25	3.0, 8.0
	Leukocyty12,13,26,27	3.0, 5.0
	Mięśnie gładkie28-30	8.0
Inwazja Inwazja guza Bariera krew-mózg Krew/krążenie	p>Melanoma31-33	8.0
	Glejak Chłoniak34-36, Jurkat38	8.0
	Osteoblasty39,41-43	5.0, 8.0
	Rak piersi37,40	8.0
	Rak śródbłonka40,44-49	3.0, 8.0

Wiszące wkładki do hodowli komórkowych Millicell^® mają kilka opcji zgodnych z testami migracji i inwazji (pokazanymi w tabeli 2). Wszystkie wkładki są pakowane pojedynczo w blistry i pasują do standardowych płytek do hodowli tkankowych.    

Tabela 2. Millicell^® Cell Culture Inserts for Migration and Invasion Assays. Membrana PET jest poddawana obróbce hodowli tkankowej w celu promowania przyczepiania i wzrostu komórek.

Description	Membrane Area	Optical Property	Pore Size	Pore Size	Gęstość porów (pory/cm2)	Nr kat. No. (48/pk)
Millicell® 24-dołkowe wkłady	0.3 cm2	Translucent	3.0 µm 5.0 µm 8.0 µm	2 × 106 6 × 105 2 × 105	PTSP24H48 PTMP24H48 PTEP24H48
. Wkłady 12-dołkowe Millicell®	1.1 cm2	Translucent	3.0 µm 5.0 µm 8.0 µm	2 × 106 6 × 105 2 × 105	PTSP12H48 PTMP12H48 PTEP12H48
. Wkłady 6-dołkowe Millicell®	4.5 cm2	Translucent	3.0 µm 5.0 µm 8.0 µm	2 × 106 6 × 105 2 × 105	PTSP06H48 PTMP06H48 PTEP06H48

Optymalizacje testu migracji i inwazji

1. Wybór wkładki: Patrz "Wybór wkładki Millicell^® Cell Culture Insert do testów migracji i inwazji" w sekcji powyżej.
2. Gęstość wysiewu komórek: Ważne jest, aby zoptymalizować gęstość wysiewu dla danej linii komórkowej. Przy zbyt wysokim stężeniu komórki będą trudne do policzenia lub mogą przesycić pory w membranie. Zbyt mała liczba dodanych komórek może prowadzić do niespójnego zliczania i wyników.
3. Stężenie chemoatraktanta: Optymalizacja stężenia chemoatraktanta jest ważnym krokiem, zwłaszcza jeśli nie ma wcześniej opublikowanych danych na temat interakcji między używaną linią komórkową a chemoatraktantem. W takim przypadku dobrym rozwiązaniem może być przeprowadzenie testu z kilkoma różnymi seryjnymi rozcieńczeniami chemoatraktanta. Odpowiedź różnych typów komórek może się różnić w zależności od zastosowanego chemoatraktanta. W przypadku dobrze zbadanego chemoatraktanta, takiego jak FBS, stężenie 10% surowicy jest dobrym miejscem do rozpoczęcia optymalizacji gęstości wysiewu.
4. Czas: Ważne jest, aby zoptymalizować czas inkubacji dla testów migracji, ponieważ najbardziej odpowiedni czas inkubacji zależy od typu komórek i stosowanego chemoatraktanta (zazwyczaj 16-24 godziny to dobry punkt wyjścia, ale niektóre linie komórkowe mogą trwać dłużej).
5. Barwienie i liczenie komórek:Istnieje kilka różnych metod barwienia, które mogą być stosowane w celu obrazowania i liczenia migrujących komórek. Obejmują one fiolet krystaliczny (barwienie całych komórek) i barwnik DAPI (barwienie jąder komórkowych). Po utrwaleniu i zabarwieniu komórki można wizualizować i określać ilościowo za pomocą odwróconego mikroskopu.
6. Objętości mediów: Millicell^® wiszące wkłady do hodowli komórkowych są kompatybilne z większością płytek do hodowli tkankowych. Ponieważ wymiary studzienek mogą się nieznacznie różnić w zależności od marki, najlepszą praktyką jest zoptymalizowanie ilości pożywki potrzebnej w studzience, tak aby osiągnęła ona ten sam poziom, co pożywka w samej wkładce. Dla formatów 24-dołkowych, dobrym punktem wyjścia jest 100 µL we wkładzie i 600 µL w dołku lub 200 µL we wkładzie i 900 µL w dołku.

Migration and Invasion Assay Sample Protocol - Optimization of Seeding Density

Materiały:

• Linia komórek o wysokiej migracji/inwazyjności, np, komórki HT 1080
• Linia komórkowa o wysokiej migracji, np. komórki NIH 3T3
• Linia komórkowa o niskiej migracji, np, komórki MCF-7
• Millicell^® Cell Culture Inserts, 8 μM PET, 24-dołkowe
• Corning^® Costar^® 24-dołkowe płytki
• Kolby do hodowli tkankowych Greiner 75 cm²
• Roztwór trypsyny-EDTA
• EDTA 0.02% roztwór w D-PBS
• Corning^® Matrigel^® Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix
• Coating buffer
  • 0.01M Tris (pH 8.0)
  • 0.7% NaCl

• HT 1080 & MCF-7. pożywka apikalna / pożywka kontrolna (bez surowicy)
  o   EMEM
  o   50 jednostek Penicyliny / 50 µg/mL Streptomycyny
  o   2 mM L-glutamina
  o   niezbędne aminokwasy

• HT 1080 & MCF-7 pożywka / podstawowa pożywka testowa (10% FBS)
  o   EMEM
  o   50 jednostek penicyliny / 50 µg/mL streptomycyny
  o   2 mM L-glutamina
  o   niezbędne aminokwasy
  o   10% FBS

• NIH 3T3 podłoże hodowlane (10% surowicy cielęcej)
  o   DMEM
  o   50 jednostek penicyliny / 50 µg/ml streptomycyny
  o   2 mM L-glutamina
  o   10% surowica cielęca

• NIH 3T3 apical medium/control medium (no serum)
  o   DMEM
  o   50 jednostek penicyliny / 50 µg/ml streptomycyny
  o   2 mM L-glutamina

• NIH 3T3 basolateral test medium (10% FBS)
  o   DMEM
  o   50 jednostek Penicyliny / 50 µg/ml Streptomycyny
  o   2 mM L-glutamina
  o   10% FBS

Protokół powlekania dla testów inwazyjnych

1. Odmierz i przechowuj Matrigel^® w temperaturze -20°C. Rozmrozić podwielokrotność w lodzie lub w temperaturze 4°C.
2. Przygotować roztwór do powlekania rozcieńczając Matrigel schłodzonym buforem do powlekania do końcowego stężenia 200 µg/ml. Delikatnie zawirować w celu wymieszania i przechowywać na lodzie do czasu dalszego użycia: Schłodzić końcówki pipet i/lub inne materiały, które wejdą w kontakt z Matrigel^® podczas tego etapu.
3. Używając sterylnych kleszczyków, umieść żądaną liczbę wiszących wkładek Millicell^® w 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych.
4. Uważnie odpipetuj 100uL roztworu powlekającego na środek wierzchołkowej strony wkładek i bez wstrząsania inkubuj zamkniętą płytkę w temperaturze 37°C przez 2-3 godziny.

Dzień 1: Posiew insertów z komórkami

1. Komórki zostały odłączone od kolb do hodowli komórkowych i ponownie zawieszone w pożywce zawierającej surowicę w celu zneutralizowania trypsyny.
2. Komórki zostały dwukrotnie przepłukane w pożywce wolnej od surowicy, aby zapewnić usunięcie całej surowicy.
3. Zawiesina komórek została policzona i seryjnie rozcieńczona do wymaganych stężeń w pożywce wolnej od surowicy.
4. Używając sterylnej kleszczy, wkładki do hodowli komórkowej zostały wyjęte z opakowania i umieszczone w studzienkach płytki hodowlanej. Czynność tę powtarzano do momentu, aż pożądana liczba dołków zawierała wkładki.  Do testów inwazji należy użyć wkładek do hodowli komórkowych pokrytych ECM, jak opisano powyżej.
5. Komórki wysiano na wewnętrzną stronę wkładki, po wierzchołkowej stronie membrany (100 µL każdej zawiesiny komórek). 
6. 600 µL pożywki testowej dodano do podstawno-bocznej strony każdej wkładki w studzienkach. Pożywka ta zawierała 10% FBS jako chemoatraktant dla próbek testowych w połowie płytki, podczas gdy pożywka bez surowicy była stosowana jako kontrola w drugiej połowie płytki. Zastosowano trzy powtórzenia na gęstość wysiewu dla tych z FBS i bez FBS w pożywce. Wkładka bez komórek została dołączona jako ślepa próba kontrolna. Wysiane płytki umieszczono w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C, 5% CO₂ na 24 godziny.

Dzień 2: Ocena migrujących komórek

1. Podłoże zostało usunięte ze studzienek 24-dołkowej płytki. 
2. Używając bawełnianego wacika zwilżonego w podłożu, pozostałe komórki, które nie migrowały z wierzchołkowej strony membrany we wkładce, zostały delikatnie usunięte. Dokonano tego poprzez ostrożne kilkakrotne obracanie zwilżonego wacika wokół wkładki w kierunku zgodnym i przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Bardzo ważne jest, aby uważać, aby nie uszkodzić membrany.
3. Komórki zostały utrwalone w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut, a następnie dwukrotnie przepłukane PBS.
4. Komórki były permeabilizowane w 0,1% Triton X-100 przez 10 minut przed dwukrotnym płukaniem PBS.
5. Komórki były następnie barwione 1 µM roztworem DAPI przez 15 minut i płukane raz w PBS.
6. 900 µL wody o czystości molekularnej dodano do studzienki płytki 24-dołkowej, a 200 µL do wierzchołkowej strony wkładki w płytce 24-dołkowej. 
7. Wkładki zostały zobrazowane bezpośrednio z płytki 24-dołkowej na filtrze DAPI przy użyciu obiektywu 10x. Ważne jest, aby ustawienia obrazu były spójne między próbkami. 
8. Obrazy zostały pozyskane, a migrujące komórki zostały policzone w czterech polach widzenia dla każdej płytki.
9. Konserwacja 0,5% fioletem krystalicznym została również zakończona. 900 µl PBS dodano do studzienki 24-dołkowej płytki, a 200 µl wody o czystości molekularnej do wierzchołkowej strony wkładki w 24-dołkowej płytce przed obrazowaniem.

Próbki można zapisać i ponownie wybarwić w razie potrzeby. Wkładki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w wodzie o czystości molekularnej.

Rysunek 2. Przykładowy układ 24-dołkowej płytki do optymalizacji gęstości wysiewu dla testów migracji komórek (lub testów inwazji w przypadku stosowania wkładek pokrytych Matrigel^®).

Dane z testów migracji i inwazji

Testy migracji i inwazji przeprowadzono zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Barwienie fioletem krystalicznym przeprowadzono po tych 24-godzinnych testach migracji dla trzech linii komórkowych (HT 1080, NIH 3T3 i MCF-7) z i bez 10% FBS. Pozwoliło to na wyraźne zobrazowanie migrujących komórek, pokazując poziom migracji dla każdej linii komórkowej w każdych warunkach (obrazy pokazane na rysunku 3). Komórki HT 1080 są zdolne do inwazji i migracji, komórki NIH 3T3 są zdolne do migracji tylko w warunkach opisanych w tym eksperymencie, podczas gdy komórki MCF-7 nie są zdolne do migracji przez pory w kierunku chemoatraktanta.

Rysunek 3. Barwienie fioletem krystalicznym migrujących komórek (A - HT1080, B - NIH 3T3, C - MCF-7) na podstawno-bocznej stronie membrany po 24 godzinach, z i bez 10% FBS i Matrigel^® (200 µg/mL), przy różnych gęstościach wysiewu. Reprezentatywne obrazy są pokazane z jednego pola widzenia, z jednego replikatu płytki przy każdej gęstości wysiewu. Linie komórkowe HT 1080 i NIH 3T3 mogą migrować przez pory w kierunku chemoatraktanta, podczas gdy komórki MCF-7 nie. Tylko linia komórkowa HT 1080 może przenikać przez membranę pokrytą Matrigel^®.

Oprócz barwienia fioletem krystalicznym, komórki zabarwiono również DAPI, aby umożliwić obrazowanie i zliczanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (pokazane na rysunku 4). Obrazowanie zakończono przy użyciu obiektywu 10x z filtrem DAPI. Po uzyskaniu obrazów migrujące/inwazyjne komórki można było policzyć w czterech polach widzenia dla każdej wstawki. DAPI jest barwnikiem jądrowym, który pozwala na łatwiejsze zliczanie migrujących/inwazyjnych komórek, zwłaszcza gdy występuje duża liczba komórek w wyższych gęstościach siewu.

Rysunek 4. Barwienie DAPI migrujących komórek (A - HT1080, B - NIH 3T3, C - MCF-7) na podstawno-bocznej stronie membrany po 24 godzinach, z i bez 10% FBS i Matrigel^® (200 µg/mL), przy różnych gęstościach wysiewu. Reprezentatywne obrazy są pokazane z jednego pola widzenia, z jednego replikatu płytki przy każdej gęstości wysiewu. Linie komórkowe HT 1080 i NIH 3T3 mogą migrować przez pory w kierunku chemoatraktanta, podczas gdy komórki MCF-7 nie. Tylko linia komórkowa HT 1080 może przedostać się przez membranę pokrytą Matrigel^®.

Celem tego eksperymentu była optymalizacja gęstości wysiewu dla testów migracji i inwazji przy użyciu 10% FBS jako chemoatraktanta dla trzech różnych linii komórkowych, po 24 godzinach inkubacji. Liczbę komórek, które uległy migracji lub inwazji w każdej wstawce obliczono poprzez uśrednienie liczby komórek w czterech polach widzenia po barwieniu DAPI i obrazowaniu. Graficzną reprezentację wyników przedstawiono na rysunku 5. Wyniki te pozwoliły nam określić, że optymalna gęstość wysiewu w tym eksperymencie wynosiła 25 000 komórek na insert zarówno dla testów migracji, jak i inwazji. Zaobserwowano dobrą separację liczby komórek między insertami zawierającymi chemoatraktant (+FBS) i kontrolę negatywną (-FBS), przy gęstości wysiewu 25 000 komórek na insert wykazującej najlepszy stosunek sygnału do szumu dla dwóch migrujących linii komórkowych (5:1 i 6:1 odpowiednio dla HT 1080 i NIH 3T3). Odpowiednie kontrole zostały przetestowane dla każdej linii komórkowej w celu porównania zarówno z warunkami z FBS, jak i bez niego (dane nie pokazane). Odpowiednia gęstość wysiewu zależy od konkretnych warunków, które mają być testowane przez użytkownika (np. czas migracji, zastosowana linia komórkowa, zastosowany chemoatraktant itp.

Rysunek 5. Kwantyfikacja migrujących komórek po podstawno-bocznej stronie membran po 24 godzinach, z i bez 10% FBS i Matrigel^® (200 µg/mL), przy różnych gęstościach wysiewu (pokazująca średnią komórek zliczonych z czterech pól widzenia, z trzech powtórzeń wstawek). Linie komórkowe HT 1080 i NIH 3T3 mogą migrować przez pory w kierunku chemoatraktanta, podczas gdy komórki MCF-7 nie. Tylko linia komórkowa HT 1080 może przedostać się przez membranę pokrytą Matrigel^®.

Wskazówki i porady dotyczące testu migracji i inwazji

• Ważne jest, aby uwzględnić wkładki hodowli komórkowej w pożywce bez chemoatraktantu jako kontrolę ujemną, a także w celu identyfikacji migracji w tle. Dodatkowo, niemigrujące linie komórkowe (np. MCF-7) mogą być używane jako dodatkowa kontrola.
• Przy przygotowywaniu zawiesin komórkowych należy uważać, aby rozbić grudki komórek (delikatnie pipetować ręcznie pipetorem o mniejszym otworze), aby uniknąć agregacji komórek w środku lub na krawędziach wkładki. Zawsze używaj podgrzanej pożywki, aby upewnić się, że komórki się nie agregują.
• Upewnij się, że wkłady do hodowli komórkowej są prawidłowo umieszczone w studzience płytki do hodowli tkankowej. Istnieje kilka różnych typów płytek, które mogą być używane z wiszącymi wkładkami, dlatego ważne jest, aby wkładki były prawidłowo osadzone, aby umożliwić równomierną migrację/inwazję. Upewnij się, że pokrywa płytki może się prawidłowo zamknąć, aby zapobiec parowaniu podczas inkubacji (możesz użyć czystej dłoni w rękawiczce, aby przenieść wkładki do hodowli komórkowej na miejsce po przeniesieniu za pomocą kleszczyków, jeśli przesuwają się z miejsca).
  
• Pamiętaj, aby zawiesić komórki w pożywce bez surowicy i delikatnie pipetować je kilka razy przed posianiem ich do dołków, aby uniknąć zanieczyszczenia i zmniejszyć zlepianie się komórek.
• Kluczowe jest zoptymalizowanie różnych parametrów, takich jak czas trwania inwazji, gęstość wysiewu i stężenie Matrigel^® w zależności od eksperymentu i wybranego typu komórek w celu uzyskania lepszej dokładności i wyników.
• Na początku napełnij butelkę Matrigel^®, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania. Rozmrażaj poszczególne fiolki w razie potrzeby.
• W miarę możliwości unikaj pęcherzyków powietrza podczas pipetowania Matrigel^® do każdej wkładki.
• Upewnij się, że powłoka Matrigel^® jest równomiernie rozprowadzona i zestalona przed posianiem komórek. Użyj kleszczyków, aby podnieść wkładkę i dokonać oględzin.
• Bądź bardzo ostrożny podczas usuwania komórek niemigrujących/inwazyjnych z wierzchołkowej strony membrany. Zbyt silny nacisk może doprowadzić do oderwania się membrany lub może spowodować przemieszczenie się niektórych komórek, które migrowały/inwazyjnie (Rysunek 6).
• Podnieś wkładki do hodowli komórkowej za pomocą kleszczyków, a następnie przenieś wkładkę na czystą dłoń w rękawiczce, aby ułatwić chwytanie podczas wymazywania wkładki. Upewnij się, że nie dotykasz samej membrany w tym procesie.
• Można stosować różne środki utrwalające, takie jak 70% etanol lub 7% paraformaldehyd. Używając alkoholu do utrwalania komórek, w połączeniu z barwieniem fioletem krystalicznym, upewnij się, że obrazujesz i liczysz komórki w ciągu kilku dni, ponieważ struktury komórkowe mogą wydawać się rozmyte i mogą być trudniejsze do policzenia, jeśli zostaną pozostawione na zbyt długo.
• Po barwieniu, wkładki Millicell^® powinny być odpowiednio przechowywane, aby uniknąć wysychania i rozmytych obrazów.

Rysunek 6. Barwienie fioletem krystalicznym wkładek Millicell^®. A. Podczas wyjmowania wkładki Millicell^® zastosowano zbyt duży nacisk, co spowodowało wgniecenie membrany i sprawiło, że wkładka nie znajdowała się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej podczas obrazowania. B. Barwienie fioletem krystalicznym wkładów Millicell^® przy użyciu etanolu jako środka utrwalającego. W przypadku stosowania etanolu jako środka utrwalającego, próbki powinny być obrazowane tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zniekształcenia morfologii komórek przez etanol.

References

.

1 - 20

1. Horwitz R, Webb D. 2003. Cell migration. Current Biology. 13(19):R756-R759. https://doi.org/10.1016/j.cub.2003.09.014

2. Boyden S. 1962. THE CHEMOTACTIC EFFECT OF MIXTURES OF ANTIBODY AND ANTIGEN ON POLYMORPHONUCLEAR LEUCOCYTES. 115(3):453-466. https://doi.org/10.1084/jem.115.3.453

3. Sawamiphak S, Ritter M, Acker-Palmer A. 2010. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5(10):1659-1665. https://doi.org/10.1038/nprot.2010.130

4. Tamari T, Kawar-Jaraisy R, Doppelt O, Giladi B, Sabbah N, Zigdon-Giladi H. The Paracrine Role of Endothelial Cells in Bone Formation via CXCR4/SDF-1 Pathway. Cells. 9(6):1325. https://doi.org/10.3390/cells9061325

5. Hamdollah Zadeh M, Glass CA, Magnussen A, Hancox JC, Bates DO. 2008. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial CellsIn Vitroare Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15(7):605-614. https://doi.org/10.1080/10739680802220323

6. Hadjichristou C, Papachristou E, Bonovolias I, Bakopoulou A. 2020. Three-dimensional tissue engineering-based Dentin/Pulp tissue analogue as advanced biocompatibility evaluation tool of dental restorative materials. Dental Materials. 36(2):229-248. https://doi.org/10.1016/j.dental.2019.11.013

7. DU H, SHI H, CHEN D, ZHOU Y, CHE G. 2015. Cross-talk between endothelial and tumor cells via basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor signaling promotes lung cancer growth and angiogenesis. 9(3):1089-1094. https://doi.org/10.3892/ol.2015.2881

8. Matsushita T, Kibayashi T, Katayama T, Yamashita Y, Suzuki S, Kawamata J, Honmou O, Minami M, Shimohama S. 2011. Mesenchymal stem cells transmigrate across brain microvascular endothelial cell monolayers through transiently formed inter-endothelial gaps. Neuroscience Letters. 502(1):41-45. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2011.07.021

9. Sanders SP, Proud D. Viral Modulation of airway inflammation. Asthma: Causes and Mechanisms, 4; 1999. 23 p.

10. Horbett TA, Klumb, LA. Cell culturing: surface aspects and considerations. New York, NY: Marcel Dekker, Inc.; 1996. 351-445 p:

11. Kidney JC, Proud D. 2000. Neutrophil Transmigration across Human Airway Epithelial Monolayers. Am J Respir Cell Mol Biol. 23(3):389-395. https://doi.org/10.1165/ajrcmb.23.3.4068

12. Van Oostveldt K, Paape M, Burvenich C. 2002. Apoptosis of Bovine Neutrophils Following Diapedesis Through a Monolayer of Endothelial and Mammary Epithelial Cells. Journal of Dairy Science. 85(1):139-147. https://doi.org/10.3168/jds.s0022-0302(02)74062-9

13. Welch HC, Condliffe AM, Milne LJ, Ferguson GJ, Hill K, Webb LM, Okkenhaug K, Coadwell WJ, Andrews SR, Thelen M, et al. 2005. P-Rex1 Regulates Neutrophil Function. Current Biology. 15(20):1867-1873. https://doi.org/10.1016/j.cub.2005.09.050

14. Heise R, Vetter-Kauczok CS, Skazik C, Czaja K, Marquardt Y, Lue H, Merk HF, Bernhagen J, Baron JM. 2012. Expression and Function of Macrophage Migration Inhibitory Factor in the Pathogenesis of UV-Induced Cutaneous Nonmelanoma Skin Cancer?. 88(5):1157-1164. https://doi.org/10.1111/j.1751-1097.2012.01108.x

15. Wang X, Ma G, Zhang R, Liu L, Zhu J, Zhu H. 2019. Molecular characterization and biological functioning of interleukin-8 in Siberian sturgeon (Acipenser baeri). Fish & Shellfish Immunology. 9091-101. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2019.04.010

16. Cappione A, Chen C, Neville SC, Nadler ST. A comprehensive workflow for screening and real-time analysis of cell migration. SigmaAldrich, 2016:

17. Spary LK, Salimu J, Webber JP, Clayton A, Mason MD, Tabi Z. 2014. Tumor stroma-derived factors skew monocyte to dendritic cell differentiation toward a suppressive CD14⁺PD-L1⁺phenotype in prostate cancer. OncoImmunology. 3(9):e955331. https://doi.org/10.4161/21624011.2014.955331

18. Sokolowski JD, Chabanon-Hicks CN, Han CZ, Heffron DS, Mandell JW. Fractalkine is a â??find-meâ? signal released by neurons undergoing ethanol-induced apoptosis. Front. Cell. Neurosci.. 8 https://doi.org/10.3389/fncel.2014.00360

19. Pruyn SA. Stability and Biodistribution of Endocannabinoids Across the Human Brain Microvascular Endothelium Barrier. Albany College of Pharmacy and Health Sciences; 2019:

20. Tucci M, Ciavarella S, Strippoli S, Brunetti O, Dammacco F, Silvestris F. 2011. Immature dendritic cells from patients with multiple myeloma are prone to osteoclast differentiation in vitro. Experimental Hematology. 39(7):773-783.e1. https://doi.org/10.1016/j.exphem.2011.04.006

21 - 40

21. Fell LH, Seiler-Mußler S, Sellier AB, Rotter B, Winter P, Sester M, Fliser D, Heine GH, Zawada AM. 2016. Impact of individual intravenous iron preparations on the differentiation of monocytes towards macrophages and dendritic cells. Nephrol. Dial. Transplant.. 31(11):1835-1845. https://doi.org/10.1093/ndt/gfw045

22. Su Q, Igyártó BZ. 2019. Keratinocytes Share Gene Expression Fingerprint with Epidermal Langerhans Cells via mRNA Transfer. Journal of Investigative Dermatology. 139(11):2313-2323.e8. https://doi.org/10.1016/j.jid.2019.05.006

23. Lee D, Cho K. 2005. The effects of epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts on the formation of cutaneous basement membrane in three-dimensional culture systems. Arch Dermatol Res. 296(7):296-302. https://doi.org/10.1007/s00403-004-0529-5

24. Díaz-Coránguez M, Segovia J, López-Ornelas A, Puerta-Guardo H, Ludert J, Chávez B, Meraz-Cruz N, González-Mariscal L. Transmigration of Neural Stem Cells across the Blood Brain Barrier Induced by Glioma Cells. PLoS ONE. 8(4):e60655. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0060655

25. Huang S, Liu F, Niu Q, Li Y, Liu C, Zhang L, Ni D, Pu X. GLIPR-2 Overexpression in HK-2 Cells Promotes Cell EMT and Migration through ERK1/2 Activation. PLoS ONE. 8(3):e58574. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058574

26. den Broeder AA, Wanten GJ, Oyen WJ, Naber T, van Riel PL, Barrera P. Neutrophil migration and production of reactive oxygen species during treatment with a fully human anti-tumor necrosis factor-alpha monoclonal antibody in patients with rheumatoid arthritis. The Journal of rheumatology. 2003; 30(2)232-237:

27. Nishihara H, Soldati S, Mossu A, Rosito M, Rudolph H, Muller WA, Latorre D, Sallusto F, Sospedra M, Martin R, et al. 2020. Human CD4+ T cell subsets differ in their abilities to cross endothelial and epithelial brain barriers in vitro. Fluids Barriers CNS. 17(1): https://doi.org/10.1186/s12987-019-0165-2

28. Zhang R, Wu Y, Zhao M, Liu C, Zhou L, Shen S, Liao S, Yang K, Li Q, Wan H. 2009. Role of HIF-1? in the regulation ACE and ACE2 expression in hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297(4):L631-L640. https://doi.org/10.1152/ajplung.90415.2008

29. Ning Y, Sun Q, Dong Y, Xu W, Zhang W, Huang H, Li Q. 2011. Slit2-N inhibits PDGF-induced migration in rat airway smooth muscle cells: WASP and Arp2/3 involved. Toxicology. 283(1):32-40. https://doi.org/10.1016/j.tox.2011.01.026

30. Wang Y, Wang HJ, Liao Y, Tsai P, Chen K, Cheng H, Lin R, Juo SH. 2012. MicroRNA-195 regulates vascular smooth muscle cell phenotype and prevents neointimal formation. 95(4):517-526. https://doi.org/10.1093/cvr/cvs223

31. Zhang W, Tang B, Huang Q, Hua Z. 2013. Galangin inhibits tumor growth and metastasis of B16F10 melanoma. J. Cell. Biochem.. 114(1):152-161. https://doi.org/10.1002/jcb.24312

32. Schittek B, Psenner K, Sauer B, Meier F, Iftner T, Garbe C. 2007. The increased expression of Y box-binding protein 1 in melanoma stimulates proliferation and tumor invasion, antagonizes apoptosis and enhances chemoresistance. Int. J. Cancer. 120(10):2110-2118. https://doi.org/10.1002/ijc.22512

33. Meier F, Busch S, Lasithiotakis K, Kulms D, Garbe C, Maczey E, Herlyn M, Schittek B. 2007. Combined targeting of MAPK and AKT signalling pathways is a promising strategy for melanoma treatment. Br J Dermatol. 156(6):1204-1213. https://doi.org/10.1111/j.1365-2133.2007.07821.x

34. Wang Y, Chang S, Wang C, Huang H, Tzeng S. 2020. The selective lipoprotein-associated phospholipase A2 inhibitor darapladib triggers irreversible actions on glioma cell apoptosis and mitochondrial dysfunction. Toxicology and Applied Pharmacology. 402115133. https://doi.org/10.1016/j.taap.2020.115133

35. Bajetto A, Barbieri F, Dorcaratto A, Barbero S, Daga A, Porcile C, Ravetti JL, Zona G, Spaziante R, Corte G, et al. 2006. Expression of CXC chemokine receptors 1?5 and their ligands in human glioma tissues: Role of CXCR4 and SDF1 in glioma cell proliferation and migration. Neurochemistry International. 49(5):423-432. https://doi.org/10.1016/j.neuint.2006.03.003

36. Luo L, Zhang L, Duan C, Wang B, He N, Abulimiti P, Lin Y. 2017. The inhibition role of miR-22 in hepatocellular carcinoma cell migration and invasion via targeting CD147. Cancer Cell Int. 17(1): https://doi.org/10.1186/s12935-016-0380-8

37. Li J, Zhang S, Chen J, Du T, Wang Y, Wang Z. 2009. Modeled microgravity causes changes in the cytoskeleton and focal adhesions, and decreases in migration in malignant human MCF-7 cells. Protoplasma. 238(1-4):23-33. https://doi.org/10.1007/s00709-009-0068-1

38. Baumann L, Prokoph S, Gabriel C, Freudenberg U, Werner C, Beck-Sickinger AG. 2012. A novel, biased-like SDF-1 derivative acts synergistically with starPEG-based heparin hydrogels and improves eEPC migration in vitro. Journal of Controlled Release. 162(1):68-75. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2012.04.049

39. CADET ER, GAFNI RI, MCCARTHY EF, MCCRAY DR, BACHER JD, BARNES KM, BARON J. 2003. MECHANISMS RESPONSIBLE FOR LONGITUDINAL GROWTH OF THE CORTEX. The Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 85(9):1739-1748. https://doi.org/10.2106/00004623-200309000-00013

40. Zhao F, Li L, Guan L, Yang H, Wu C, Liu Y. 2014. Roles for GP IIb/IIIa and ?v?3 integrins in MDA-MB-231 cell invasion and shear flow-induced cancer cell mechanotransduction. Cancer Letters. 344(1):62-73. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2013.10.019

41 - 49

41. Jiang R, Zhang C, Liu G, Gu R, Wu H. MicroRNA-101 inhibits proliferation, migration and invasion in osteosarcoma cells by targeting ROCK1. American journal of cancer research, 2017; 7(1)88:

42. Jia D, Niu Y, Li D, Liu Z. 2018. lncRNA C2dat1 Promotes Cell Proliferation, Migration, and Invasion by Targeting miR-34a-5p in Osteosarcoma Cells. oncol res. 26(5):753-764. https://doi.org/10.3727/096504017x15024946480113

43. Zhang J, Yang W, Zhou Y, Xiang Y, Wang L, Hu W, Wang W. Baicalein inhibits osteosarcoma cell proliferation and invasion through the miR?183/Ezrin pathway. Mol Med Report. https://doi.org/10.3892/mmr.2018.9036

44. Liu Y, Zhao F, Gu W, Yang H, Meng Q, Zhang Y, Yang H, Duan Q. 2009. The Roles of Platelet GPIIb/IIIa and ?v?3 Integrins during HeLa Cells Adhesion, Migration, and Invasion to Monolayer Endothelium under Static and Dynamic Shear Flow. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 20091-9. https://doi.org/10.1155/2009/829243

45. Toyoda K, Tanaka K, Nakagawa S, Thuy DHD, Ujifuku K, Kamada K, Hayashi K, Matsuo T, Nagata I, Niwa M. 2013. Initial Contact of Glioblastoma Cells with Existing Normal Brain Endothelial Cells Strengthen the Barrier Function via Fibroblast Growth Factor 2 Secretion: A New In Vitro Blood?Brain Barrier Model. Cell Mol Neurobiol. 33(4):489-501. https://doi.org/10.1007/s10571-013-9913-z

46. Hu M, Wang C, Li W, Lu W, Bai Z, Qin D, Yan Q, Zhu J, Krueger BJ, Renne R, et al. A KSHV microRNA Directly Targets G Protein-Coupled Receptor Kinase 2 to Promote the Migration and Invasion of Endothelial Cells by Inducing CXCR2 and Activating AKT Signaling. PLoS Pathog. 11(9):e1005171. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005171

47. Coureuil M, Lécuyer H, Scott MG, Boularan C, Enslen H, Soyer M, Mikaty G, Bourdoulous S, Nassif X, Marullo S. 2010. Meningococcus Hijacks a ?2-Adrenoceptor/?-Arrestin Pathway to Cross Brain Microvasculature Endothelium. Cell. 143(7):1149-1160. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.11.035

48. Almajed FS, Forsythe SJ. 2016. Cronobacter sakazakii clinical isolates overcome host barriers and evade the immune response. Microbial Pathogenesis. 9055-63. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2015.11.014

49. Tian X, Hu T, Zhang H, He L, Huang X, Liu Q, Yu W, He L, Yang Z, Zhang Z, et al. 2013. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23(9):1075-1090. https://doi.org/10.1038/cr.2013.83