Przejdź do zawartości
Merck
Strona głównaInterakcje białek i kwasów nukleinowychProtokół fluorescencji Duolink® PLA

Protokół fluorescencji Duolink® PLA

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie odczynników Duolink® PLA do immunofluorescencyjnego wykrywania, wizualizacji i kwantyfikacji poszczególnych białek, modyfikacji białek i interakcji białek w próbkach tkanek i komórek. Aby zapoznać się z technologią Duolink® PLA, pobierz naszą broszurę i zapoznaj się z Jak zoptymalizować test ligacji zbliżeniowej Duolink®, aby uzyskać więcej informacji. Inne protokoły można znaleźć w Protokół Duolink® PLA Brightfield oraz Duolink® PLA Probemaker User Guide. 

Materiały i sprzęt
Protokół fluorescencji PLA Duolink®
./a>
Wyniki
Rozwiązywanie problemów
Referencje

Materiały i sprzęt

Duolink® Odczynniki PLA

Zalecenia dotyczące konkretnych produktów można znaleźć w Przewodniku doboru produktów Duolink® PLA. Krótko mówiąc, aby przeprowadzić eksperyment Duolink® PLA do wykrywania fluorescencji, potrzebne są następujące produkty Duolink® PLA:

  1. Duolink® PLA Probes (jeden PLUS i jeden MINUS z różnych gatunków, pasujących do gatunków gospodarza przeciwciał pierwotnych). Każdy zestaw zawiera:
    1. PLA Probes (5x) - PLUS i/lub MINUS, w zależności od produktu
    2. Blocking Solution - Roztwór blokujący. Do blokowania próbki przed inkubacją przeciwciał
    3. Rozcieńczalnik przeciwciał - Do rozcieńczania sond PLA i, w razie potrzeby, przeciwciał pierwszorzędowych
    UWAGA: Wszystkie składniki zestawu należy przechowywać w temperaturze 4 °C.

    Uwaga: Zestawy Duolink® PLA Probemaker PLUS i/lub Probemaker MINUS mogą być używane do generowania niestandardowych sond PLA w razie potrzeby. Szczegółowe informacje można znaleźć w Przewodniku Probemaker.

  2. Duolink® Fluorescent Detection Reagent (do wyboru zielony, pomarańczowy, czerwony i daleko czerwony). Każdy zestaw zawiera:
    1. Ligation Stock (5x) - rozcieńczony do sporządzenia 1x Ligation Buffer
    2. Ligase (1 U/μL) - dodany do sporządzenia Ligation Solution
    3. Amplification Stock (5x)- Rozcieńczony do sporządzenia 1x Amplification Buffer
    4. Polymerase (10 U/μL)- Dodany do sporządzenia Amplification Solution
    UWAGA: Wszystkie składniki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Bufory płuczące do fluorescencji. (A i B)
  4. Podłoża montażowe Duolink® Mounting Media with DAPI (do stosowania na szkiełkach, przechowywać w temperaturze 2-8 °C) LUB Nuclear Stain and Anti-fade  (do stosowania w mikropłytkach, przechowywać w temperaturze -20 °C)
.

Materiały dodatkowe

  1. Pierwotne przeciwciała wybrane do wykrywania interesujących białek. Muszą być hodowane na myszach, królikach lub kozach, gdy są używane w połączeniu z sondami Duolink® PLA.
  2. Woda o wysokiej czystości (sterylnie filtrowana, Milli-Q® lub podobna)
  3. Próbka (komórki lub tkanka) na szkiełku, wstępnie przygotowana pod kątem utrwalania, odzyskiwania i permeabilizacji. Sugestie i zalecenia oraz szczegółowe informacje na poniższe tematy można znaleźć w części Jak zoptymalizować test ligacji zbliżeniowej Duolink®:
    1. Projekt eksperymentalny i kontrole
    2. Wybór przeciwciał pierwotnych i optymalizacja
    3. Obróbka próbek

Sprzęt

  1. Mikroskop fluorescencyjny z odpowiednimi filtrami, kamerą i oprogramowaniem do akwizycji obrazu
  2. Inkubator 37 °C
  3. Wytrząsarka orbitalna
  4. Podgrzewana komora wilgotnościowa lub Microplate Heat Transfer Block
  5. Pióro hydrofobowe do wyznaczania obszaru reakcji
  6. Blok zamrażarki (dla enzymów)
  7. Słoiki podtrzymujące
  8. Pęsety
  9. Pipety i końcówki (od 1 μL do 1000 μL)
  10. Okładki kompatybilne z mikroskopią fluorescencyjną

Duolink® Protokół fluorescencji PLA

Następujący protokół dotyczy próbki o wielkości 1 cm2 na szkiełku, wymagającej 40 µL roztworu do odpowiedniego pokrycia. Dostosuj objętość do obszaru reakcji i liczby próbek. Wszystkie inkubacje powinny być przeprowadzane w komorze wilgotnościowej. Wszystkie etapy płukania powinny być wykonywane w temperaturze pokojowej w słoiku do barwienia z co najmniej 70 ml buforu z delikatnym mieszaniem.

Przygotowanie odczynników

  1. Bufory do płukania A i B należy przygotować przed rozpoczęciem testu, rozpuszczając zawartość jednej saszetki w wodzie o wysokiej czystości do końcowej objętości 1000 ml. Roztwory mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej w przypadku przechowywania krótkoterminowego (mniej niż dwa tygodnie) lub w temperaturze 4°C w przypadku przechowywania długoterminowego. UWAGA: Doprowadź roztwory do temperatury pokojowej przed użyciem.
  2. 0.01x Wash Buffer B należy przygotować przed rozpoczęciem testu, rozcieńczając 1x Wash Buffer B 1:100 w wodzie o wysokiej czystości.
  3. Wiele odczynników Duolink® PLA jest dostarczanych jako stężone zapasy i należy je rozcieńczyć bezpośrednio przed użyciem. Nie należy przechowywać rozcieńczonych odczynników Duolink® PLA.

Protokół Duolink® PLA

Przed rozpoczęciem próbki należy umieścić na szklanych szkiełkach i poddać wstępnej obróbce w zakresie utrwalania, odzyskiwania i/lub permeabilizacji. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z Jak zoptymalizować test ligacji zbliżeniowej Duolink®.

  1. Blokowanie
    1. Wiruj roztwór blokujący Duolink®.
    2. Dodaj 1 kroplę (~40 µl) roztworu blokującego Duolink® do każdego 1 cm2 próbki. Upewnij się, że cała próbka została pokryta roztworem blokującym.
    3. Ikubuj szkiełka w ogrzewanej komorze wilgotnościowej przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Inubacja z przeciwciałem pierwotnym UWAGA: Nie pozwól na wyschnięcie szkiełka przed dodaniem przeciwciała, ponieważ może to spowodować powstanie tła.
    1. Wiruj Duolink® Antibody Diluent.
    2. Rozcieńczyć pierwotne przeciwciało lub przeciwciała do odpowiedniego stężenia w Duolink® Antibody Diluent.
    3. Odetkaj roztwór blokujący Duolink® ze szkiełek mikroskopowych
    4. Dodaj roztwór przeciwciała pierwotnego do każdej próbki.
    5. Inkubuj szkiełka mikroskopowe w komorze wilgotnościowej. Użyj optymalnej temperatury i czasu inkubacji dla przeciwciał pierwotnych.
  3. Duolink® PLA Probe Incubation
    4. /b>
    1. Wiruj sondy PLUS i MINUS PLA
    2. Rozcieńcz sondy PLUS i MINUS PLA 1:5 w Duolink® Antibody Diluent.
      Dla reakcji 40 µL, weź 8 µL roztworu MINUS sondy PLA, 8 µL roztworu PLUS sondy PLA i 24 µL rozcieńczalnika przeciwciał. Przygotować roztwór wystarczający dla wszystkich próbek.
    3. Odetkać roztwór przeciwciała pierwotnego ze szkiełek
    4. Płukać szkiełka 2x 5 minut w 1x buforze płuczącym A w temperaturze pokojowej.
    5. Odetrzeć nadmiar buforu płuczącego i nałożyć roztwór sondy PLA.
    6. Inkubować szkiełka we wstępnie ogrzanej komorze wilgotnościowej przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  4. Ligacja
    UWAGA: Poczekać z dodaniem ligazy do momentu bezpośrednio przed dodaniem do próbki. Upewnij się, że bufor ligacyjny jest całkowicie rozmrożony i dobrze wymieszany przed użyciem.
    1. Rozcieńczyć 5x bufor ligacyjny Duolink® w stosunku 1:5 w wodzie o wysokiej czystości i wymieszać.
      Dla reakcji 40 µL dodać 8 µL buforu ligacyjnego 5x do 32 µL wody o wysokiej czystości. Przygotować wystarczającą ilość roztworu dla wszystkich próbek.
    2. Zetrzeć roztwór sondy PLA ze szkiełek.
    3. Płukać szkiełka 2x 5 minut w 1x buforze płuczącym A w temperaturze pokojowej.
    4.  Podczas płukania wyjmij Ligazę z zamrażarki za pomocą bloku zamrażarki (-20 °C).
    5. Dodaj Ligazę do 1x buforu do ligacji z kroku (a) w rozcieńczeniu 1:40 i wymieszaj.
      Dla 40 µL roztworu do ligacji, dodaj 1 µL ligazy do 39 µL 1x buforu do ligacji.
    6. Odetkaj nadmiar buforu do płukania i nałóż roztwór do ligacji.
    7. Inkubować szkiełka we wstępnie ogrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Amplifikacja
    UWAGA: Poczekać z dodaniem polimerazy do momentu bezpośrednio przed dodaniem próbki. Bufor amplifikacyjny jest wrażliwy na światło. Chronić wszystkie roztwory zawierające bufor przed światłem.
    1. Rozcieńczyć 5x bufor do amplifikacji w stosunku 1:5 w wodzie o wysokiej czystości i wymieszać. Na 40 µL reakcji dodać 8 µL 5x buforu do amplifikacji do 32 µL wody o wysokiej czystości. Przygotuj roztwór wystarczający dla wszystkich próbek.
    2. Odetkaj roztwór ligacyjny ze szkiełek.
    3. Płucz szkiełka 2x 5 minut w 1x buforze płuczącym A w temperaturze pokojowej
    4. Podczas płukania wyjmij polimerazę z zamrażarki za pomocą bloku zamrażającego (-20 °C).
    5. Dodaj polimerazę do 1x buforu do amplifikacji z kroku (a) w rozcieńczeniu 1:80 i wymieszaj.
    6. Odetkaj nadmiar buforu do płukania i nałóż roztwór do amplifikacji.
    7. Inkubować szkiełka w uprzednio ogrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Płukanie końcowe
    UWAGA: Odczynniki wrażliwe na światło. Chronić szkiełka przed światłem przez cały czas.
    1. Odetkaj roztwór amplifikacyjny ze szkiełek.
    2. Płucz szkiełka 2x 10 minut w 1x Wash Buffer B w temperaturze pokojowej.
    3. Płucz szkiełka w 0.01x Wash Buffer B przez 1 minutę.
  7. Przygotowanie do obrazowania
    UWAGA: Duolink® In Situ Mounting Media with DAPI jest wodny i nie zestala się. Do uszczelnienia krawędzi szkiełka nakrywkowego można użyć przezroczystego lakieru do paznokci. Unikaj dostania się pęcherzyków powietrza pod szkiełko nakrywkowe.
    1. Zetrzyj nadmiar buforu płuczącego ze szkiełek.
    2. Zamontuj szkiełka nakrywkowe przy użyciu minimalnej objętości Duolink® In Situ Mounting Medium with DAPI.
    3. Odczekaj 15 minut przed analizą w mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym, używając co najmniej 20-krotnego obiektywu.
    4. Po obrazowaniu, przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze 4°C przez maksymalnie 4 dni lub w temperaturze -20°C przez maksymalnie 6 miesięcy
.

Results

Image Acquisition

Wynik eksperymentu Duolink< sup>® PLA jest zwykle oglądany przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami dla zastosowanego fluoroforu detekcyjnego.sup>® PLA jest zwykle oglądany przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami dla zastosowanego fluoroforu detekcyjnego. Sygnał Duolink® PLA jest rozpoznawany jako dyskretne plamki fluorescencyjne w różnych miejscach badanych komórek (Rysunek 1A). Poszczególne sygnały mają rozmiar poniżej mikrometra i mogą znajdować się w wielu płaszczyznach ogniskowych. W związku z tym konieczne może być uzyskanie obrazów na całej grubości próbki. Jednak obrazy mogą być pozyskiwane tylko w jednej płaszczyźnie, o ile wszystkie obrazy do porównania są pozyskiwane w podobnej pozycji w próbce. Należy zauważyć, że kilka sygnałów jest często wykrywanych w technicznych kontrolach negatywnych (np. bez przeciwciał pierwotnych, Rysunek 1B). Jeśli jednak uzyskuje się więcej niż jeden lub dwa sygnały na dziesięć komórek, może być konieczne dalsze miareczkowanie przeciwciała pierwotnego

Wykrywanie EGFR w preparatach cytospinowych komórek A431 przy użyciu Duolink® PLA

Rysunek 1.Wykrywanie EGFR w preparatach cytospinowych komórek A431 przy użyciu Duolink® PLA. Zdjęcia przedstawiają projekcję maksymalnej intensywności surowego obrazu opartego na 20 płaszczyznach z. Sygnały PLA są pokazane na czerwono, a jądra na niebiesko. Obraz jądra został uzyskany w jednej płaszczyźnie z. A) Reakcja pozytywna. B) Kontrola negatywna bez przeciwciał pierwotnych.

Ważne jest, aby te same ustawienia (czas ekspozycji, wzmocnienie, użyte filtry itp.) były używane do przechwytywania wszystkich obrazów w ramach eksperymentu. Ustawienia można zoptymalizować za pomocą kontroli pozytywnych i negatywnych. Jeśli liczba sygnałów PLA jest duża, sygnały PLA mogą się łączyć/koalescować (Rysunek 2). Może się to zdarzyć podczas badania białek o wysokiej ekspresji lub podczas przechwytywania obrazu z powodu prześwietlenia. Należy wówczas zachować ostrożność, aby ustawić ustawienia akwizycji w celu uzyskania pojedynczych sygnałów PLA. Należy zapoznać się z Duolink® PLA Troubleshooting Guide, aby uzyskać wskazówki dotyczące zapobiegania koalescencji sygnału i innych potencjalnych obszarów optymalizacji.

Wykrywanie Her2 w preparatach FFPE komórek SKBR-3 o wysokiej ekspresji przy użyciu Duolink® PLA

Rysunek 2.Wykrywanie Her2 w preparatach FFPE komórek SKBR-3 o wysokiej ekspresji przy użyciu Duolink® PLA. Zdjęcia przedstawiają projekcję maksymalnej intensywności surowego obrazu na podstawie 20 płaszczyzn z. Sygnały PLA są pokazane na czerwono, a jądra na niebiesko. Obraz jądra został uzyskany w jednej płaszczyźnie z. A) Reakcja pozytywna. B) Kontrola negatywna bez przeciwciał pierwotnych.

Analiza obrazu

Dostępnych jest kilka narzędzi do analizy obrazu, które można wykorzystać do ilościowej oceny sygnałów PLA. Dane obrazu mogą być analizowane pod kątem średniej intensywności fluorescencji sygnałów PLA i/lub całkowitej liczby sygnałów PLA na komórkę lub na obszar w komórce (Ryc. 3). Kwantyfikacja jest następnie zgłaszana jako względna w stosunku do kontroli technicznych i/lub biologicznych w ramach danego eksperymentu. Jednak wiarygodna kwantyfikacja jest możliwa tylko wtedy, gdy sygnały PLA nie uległy koalescencji, a piksele obrazu nie uległy nasyceniu.

Analiza obrazu przy użyciu oprogramowania do obrazowania

Rysunek 3.Analiza obrazu przy użyciu oprogramowania do obrazowania. Jądra wybarwione DAPI (niebieskie) zostały automatycznie wykryte, a rozmiar cytoplazmy został oszacowany przez użytkownika (zielone kontury). Sygnały PLA są pokazane na czerwono, reprezentując docelowe białko. Sygnały PLA zaznaczone białymi kółkami i jądra zaznaczone na żółto zostały określone ilościowo podczas analizy.

Troubleshooting

Prosimy zapoznać się z przewodnikiem Duolink® PLA Troubleshooting Guide zawierającym porady i wskazówki, ogólne wytyczne dotyczące rozwiązywania problemów oraz zestaw często zadawanych pytań (FAQ).

Zawsze zachęcamy do kontaktu z naszym zespołem wsparcia technicznego w celu uzyskania pomocy w eksperymentach lub z lokalnym przedstawicielem handlowym.

Usługi niestandardowe

Czy Twój eksperyment wymaga dodatkowego dostosowania? Pozwól nam wykonać tę pracę za Ciebie. Dowiedz się więcej o naszym programie usług niestandardowych, aby przyspieszyć realizację projektów Duolink® PLA.

Materiały
Loading

Referencje

1.
Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200
2.
Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947
3.
Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. https://doi.org/10.1073/pnas.0400552101
4.
Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473
Powiązane artykuły
Powiązane kategorie produktów
Zaloguj się, aby kontynuować

Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.

Nie masz konta użytkownika?