Test enzymatyczny pektynazy

1. Cel

Standaryzacja procedury oznaczania aktywności enzymatycznej pektynazy.

2. Zakres

Niniejsza procedura ma zastosowanie do numerów produktów P4716, P0690, P2401, oraz P4300.

3. Definicje

3.1 Woda oczyszczona = woda z systemu dejonizacyjnego, rezystywność > lub = 18MΩ-cm @ 25 ºC

3.2 Definicja jednostki = = Jedna jednostka uwalnia 1,0 mikromola kwasu galakturonowego z kwasu poligalakturonowego na godzinę przy pH 4,0 w temperaturze 25°C.

4. Dyskusja

Kwas poligalakturonowy + H₂O    ^Pektynaza   .> Kwas galakturonowy
Kwas poligalakturonowy + I₂     > Produkty utleniania
2Na₂S₂O₃+ I₂      > 2NaI + Na₂S₄O₆
Nadmiar jodu jest miareczkowany tiosiarczanem sodu.

5. Obowiązki

Personel laboratorium usług analitycznych powinien postępować zgodnie z niniejszą procedurą.

6. Bezpieczeństwo

Zwrócić uwagę na karty charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) w celu zapoznania się z zagrożeniami i odpowiednimi środkami ostrożności.

7. Procedura

7.1 WARUNKI:

T = 25 °C, pH = 4,0

7.2 METODA:
Titrimetryczna reakcja zatrzymania

7.3 ODCZYNNIKI:

7.3.1 
0,5%(w/v) kwas poligalakturonowy (Sub)

7.3.1.1
Przygotować przez dodanie 200 ml oczyszczonej wody do 1,00 g do 1,05 g kwasu poligalakturonowego (nr produktu P3889), mieszając.

7.3.1.2
Mieszając, doprowadzić do wrzenia i utrzymywać wrzenie przez dokładnie pięć minut. Natychmiast umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 25°C z mieszadłem zanurzeniowym. Mieszać, aż temperatura osiągnie 25°C i pozostawić roztwór do mieszania przez kolejne dziesięć minut.

7.3.1.3
Kontynuując mieszanie, dostosuj pH roztworu, dodając 0,05 ml podwielokrotności odczynnika 7.3.6 (NaOH-2) w odstępach 1-minutowych, aż do uzyskania pH 4,0. Dodawać podwielokrotności 0,05 ml 2 N NaOH, mieszając, aż do uzyskania pH od 4,00 do 4,05 przez co najmniej dziesięć minut. Jeśli obecne są cząstki, przefiltrować przez kolumnę Evergreen, maksymalnie 90 μM frit.

7.3.1.4
Ponownie sprawdzić pH i dostosować za pomocą odczynnika 7.3.3 (NaOH) w temperaturze 25 °C do 4,00 - 4,02, mieszając. pH powinno pozostać w zakresie 4,00 - 4,02 przez co najmniej 30 minut.

7.3.1.5
Może być konieczne ponowne sprawdzanie pH co piętnaście minut, aby upewnić się, że pH mieści się w zakresie od 4,00 do 4,02 w temperaturze 25 °C. Jeśli nie, dostosuj pH za pomocą 0,1N NaOH.

7.3.2
100 mM jodu (I₂)
Użyj wolumetrycznego wzorca jodu, 0,1 N (nr produktu. 318981).

7.3.3
1,0 N roztwór wodorotlenku sodu (NaOH) (Nr produktu  S2567).

7.3.4
1 M węglan sodu (Na₂CO₃)
Przygotować w oczyszczonej wodzie w stężeniu 106 mg/ml, stosując węglan sodu, odczynnik (nr produktu. S2127).

7.3.5
2.0 N kwas siarkowy (H₂SO₄)
Przygotować w oczyszczonej wodzie w stężeniu 0.06 mL/mL używając Sulfuric Acid, ACS Reagent (Product No. 258105).

7.3.6
10 N wodorotlenek sodu (NaOH-2)
Przygotować w stężeniu 400 mg/ml w wodzie oczyszczonej przy użyciu wodorotlenku sodu, odczynnik (nr produktu  S5881).

7.3.7
100 mM tiosiarczan sodu, standaryzowany (Na₂S₂O₃)
Przygotować w 3 l oczyszczonej wody, używając 78,3 g pięciowodnego tiosiarczanu sodu (nr produktu. S8503) i 0,6 g jednowodnego węglanu sodu (nr produktu  S4132). Standaryzować względem standardowego roztworu dichromianu potasu, przygotowanego z dichromianu potasu, NIST.

7.3.8
Roztwór pektynazy (enzym)
Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający około 100 jednostek/ml w zimnej oczyszczonej wodzie. Rozpuszczanie może wymagać więcej niż jednej minuty wirowania, a niektóre nierozpuszczalne cząstki mogą być nadal obecne.

7.3.9
1,0%(w/v) Skrobia (Skrobia)
Przygotować w oczyszczonej wodzie w stężeniu 10 mg/ml, gotując przez dokładnie pięć minut z mieszaniem. Schłodzić do temperatury pokojowej. Użyć skrobi rozpuszczalnej w ziemniakach (nr produktu  S2004).

7.4 METODA BADAWCZA

7.4.1
Odmierzyć pipetą (w mililitrach) następujące odczynniki do odpowiednich szklanych naczyń w trzech powtórzeniach dla kontroli i/lub próbki:

	Test	Puste
Odczynnik 7.3.1 (Sub)	4.90	4.90

7.4.2    Wymieszać przez wirowanie i wyrównać do 25 °C przez co najmniej trzy minuty. Następnie dodać:

Odczynnik 7.3.8 (Enzym)

0.100

------

7.4.3    Wymieszać przez wirowanie i inkubować Test i Blank przez dokładnie 5 minut w temperaturze 25ºC. Następnie dodać następujące składniki:

Odczynnik 7.3.2 (I2)	5.00	5.00
Odczynnik 7.3.4 (Na2CO3)	1.00	1.00

7.4.4    Wymieszać przez wirowanie i umieścić w ciemności na dokładnie 20,0 minut. Następnie dodać:

Odczynnik 7.3.5 (H2SO4)

2.00

2.00

7.4.5    Wymieszać przez wirowanie i umieścić na mieszadle w temperaturze pokojowej. Miareczkować odczynnikiem 7.3.7 (Na₂S₂O₃), aż roztwór będzie miał słabo żółty kolor. Następnie dodaj następujące składniki:

Odczynnik 7.3.9 (Skrobia)

0.10

0.10

7.4.6   Mieszając, kontynuować miareczkowanie odczynnikiem 7.3.7 (Na₂S₂O₃), aż roztwór stanie się bezbarwny. Zapisać ilość w mililitrach.

7.5 OBLICZENIA

7.5.1	Jednostki/mL enzymu  =	(mLs titranta dla ślepej próby - mLs titranta dla testu)(1)(df)(100)
		(0.100)(5.0)(2)

gdzie:
   df = Współczynnik rozcieńczenia
   1 = Jeden mikromol kwasu galakturonowego jest utleniany przez 1 mikroekwiwalent I₂
./sub>
    100 = Mikrorównoważniki S₂O₃ na mililitr titranta
    0.100 = objętość (w mililitrach) enzymu użytego w reakcji enzymatycznej
    2 = mikrowartości S₂O₃ utlenionego na mikroekwiwalent I₂ zredukowanego
   5.0 = Czas inkubacji testu w minutach na jednostkę definicji

7.5.2	Jednostki/mg białka =	Jednostki/mL enzymu
		mg białka/mL enzymu

7.6 KOŃCOWE STĘŻENIE ANALIZY
W reakcji o objętości 5,0 ml końcowe stężenia wynoszą 0,49% (w/v) kwasu poligalakturonowego i 10 jednostek pektynazy.

8. Odniesienia

1. Kertesz Z. 1955. Methods in Enzymology. 1162-164.