Cyfrowa PCR
A Technical Guide to PCR Technologies
Digital PCR to metoda PCR punktu końcowego, która służy do bezwzględnej kwantyfikacji i analizy sekwencji mniejszościowych na tle podobnych sekwencji większościowych, np.g., kwantyfikacji mutacji somatycznych. Podczas korzystania z tej techniki próbka jest pobierana do rozcieńczenia ograniczającego, a liczba reakcji pozytywnych i negatywnych jest wykorzystywana do określenia dokładnego pomiaru stężenia docelowego.
Koncepcja cyfrowego PCR (dPCR) została opracowana w 1992 roku przez Sykes i in.1 a następnie rozwinięta do formatu macierzy w nanoskali przez Kalinina i in. w 1997 roku2. Jednym z motorów ciągłego doskonalenia dPCR było wykazanie przez Vogelsteina i Kinzlera3 że rzadkie mutacje KRAS mogą być wykrywane i oznaczane ilościowo w materiale pobranym od pacjentów z rakiem jelita grubego. Vogelstein rozcieńczył próbki pobrane od pacjentów w taki sposób, że oczekiwał średnio 1 cząsteczki matrycy na 2 dołki płytki reakcyjnej. Sekwencja docelowa wokół miejsca mutacji została poddana amplifikacji, a następnie do wykrycia amplikonów wykorzystano dwie lampy Molecular Beacon (patrz Quantitative PCR i Digital PCR Detection Methods). Pierwszy Molecular Beacon był specyficzny dla regionu, który nie powinien zawierać mutacji i ten test służył jako pozytywna kontrola amplifikacji PCR. Drugi Molecular Beacon miał inną etykietę barwnika i był specyficzny dla sekwencji typu dzikiego (WT). W ten sposób reakcje wykazujące pozytywny sygnał z obu etykiet miały być WT, a te wykazujące tylko pozytywną kontrolę miały być mutantami. Ponieważ oczekiwano, że wszystkie produkty w studzience będą jednorodne w wyniku rozcieńczenia, można było dokonać dokładnego pomiaru stosunku mutanta do WT. Eksperymenty te dostarczają przykładów przeprowadzania dPCR w standardowych 96-dołkowych płytkach, ale opcje o wyższej przepustowości zostały zasugerowane przez innych, w tym Dressmana i in.4 którzy wprowadzili koncepcję wykorzystania kulek emulsyjnych do dPCR (obecnie stosowanych w systemie Bio-Rad QX100™ Droplet Digital™ PCR, ddPCR™ i instrumencie RainDrop™ firmy RainDance Technologies). W alternatywnym formacie reakcje są przeprowadzane na zintegrowanych układach fluidalnych (chipach). Chipy te mają zintegrowane komory i zawory do podziału próbek i odczynników reakcyjnych. Pierwszy komercyjny system dPCR wykorzystujący technologię chipów, BioMark™, został wprowadzony na rynek w 2006 roku przez firmę Fluidigm.
Podczas wykonywania konwencjonalnej reakcji PCR, końcowe stężenie matrycy jest proporcjonalne do początkowej liczby kopii i liczby cykli amplifikacji. Jeden eksperyment o określonej liczbie reakcji jest wykonywany na pojedynczej próbce, a wynikiem jest analiza wielkości fragmentów lub, w przypadku ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), analiza jest oszacowaniem stężenia sekwencji docelowych w reakcji na podstawie liczby cykli wymaganych do osiągnięcia cyklu kwantyfikacji (C< sub>q).sub>q); patrz Quantitative PCR. Podczas korzystania z dPCR próbka jest rozcieńczana i rozdzielana na dużą liczbę komór reakcyjnych, tak aby każda partycja zawierała jedną lub żadną kopię celu. Liczba komór reakcyjnych lub partycji różni się w zależności od systemu, od kilku tysięcy przy użyciu systemu QX100 Bio-Rad do milionów przy użyciu metody RainDrop™. PCR jest następnie wykonywany w każdej partycji, a amplikon jest wykrywany przy użyciu etykiety fluorescencyjnej (patrz qPCR and dPCR Detection Methods), tak aby zebrane dane były serią wyników pozytywnych i negatywnych. Teoretycznie skutkowałoby to pozytywnym sygnałem z partycji, która pierwotnie zawierała pojedynczą kopię celu i negatywnym (tj. brakiem sygnału) z partycji, która pierwotnie nie zawierała szablonu. Jednakże, ponieważ możliwe jest, że niektóre partycje będą zawierać więcej niż jedną kopię matrycy, rozproszenie próbki na partycje jest uważane za zgodne z rozkładem Poissona.
Teoretycznie, dPCR może być wykorzystany do przezwyciężenia niektórych trudności napotykanych podczas stosowania konwencjonalnej PCR. Podczas korzystania z dPCR próbka jest dzielona tak, że poszczególne cząsteczki kwasu nukleinowego w próbce są zlokalizowane w wielu oddzielnych regionach, a zatem wykrywanie dowolnego celu nie zależy od liczby cykli amplifikacji. Podejście to skutkuje znacznie bardziej czułym rozróżnianiem zmian krotności niż to zapewniane przez qPCR; dobrze zoptymalizowany qPCR może w najlepszym przypadku rozróżnić 1,5-krotne zmiany, podczas gdy dPCR został zgłoszony do rozróżnienia 1,2-krotnego5. Rozcieńczenie próbki sprawia, że jest to przydatne narzędzie do badania sekwencji mniejszościowych w porównaniu z większością podobnych, ale różniących się sekwencji. Na przykład dPCR może być stosowany do wykrywania somatycznego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) o niskiej częstości występowania w porównaniu z wysokim stężeniem sekwencji WT. Dzieje się tak dlatego, że gdy całkowita próbka jest rozcieńczona, rzadka sekwencja jest również rozcieńczona do pojedynczej kopii, więc będzie amplifikowana przy braku konkurencji ze strony widocznej sekwencji. Znacznie mniej partycji będzie zawierało wynik pozytywny dla rzadkiego SNP niż dla WT, więc możliwe jest dokonanie dokładnego pomiaru stosunku dwóch sekwencji.
Cyfrowa PCR ma wiele potencjalnych zastosowań, w tym wykrywanie i kwantyfikację patogenów niskiego poziomu, rzadkich sekwencji genetycznych, wariacji liczby kopii (CNV) i względnej ekspresji genów w pojedynczych komórkach. Amplifikacja klonalna możliwa dzięki jednoetapowemu dPCR jest kluczowym czynnikiem skracającym czas i obniżającym koszty wielu metod sekwencjonowania nowej generacji, a tym samym umożliwiającym genomikę osobistą.
Instrumenty
Chociaż dPCR jest stosunkowo nową technologią, wiele platform zostało opracowanych w celu zapewnienia lepszych narzędzi do analiz, takich jak; określanie bezwzględnej kwantyfikacji bez użycia standardów, wykrywanie rzadkich mutacji genetycznych przy użyciu systemów multipleksowych i identyfikowanie małych różnic krotności (<1.5) między próbkami diagnostycznymi. Niezależnie od platformy, ogólna koncepcja dPCR pozostaje taka sama: wejściowe DNA jest rozcieńczane w celu wygenerowania reakcji w nanoskali lub pikoskali zawierających 1 lub 0 kopii matrycy. Poszczególne testy qPCR odbywają się w każdej kropli zawierającej matrycę, w przeciwieństwie do zbiorczej populacji docelowego DNA3. Oprócz zwiększonej czułości wykrywania rzadkich mutacji allelicznych i pomiarów CNV, można dokonać absolutnej kwantyfikacji pozytywnych reakcji punktu końcowego, częściowo dlatego, że pomiary dPCR nie zależą od krzywych standardowych lub kalibracji próbek. Inne cechy, które można przypisać zwiększonej precyzji kwantyfikacji dPCR, obejmują powtarzalne i jednorodne generowane kropelki, a także zwiększoną liczbę analizowanych reakcji podziału6,7. Rodzaj urządzenia wybranego przez użytkownika końcowego zależy ostatecznie od konkretnego zastosowania, które zostanie przeprowadzone.
Fluidigm Corporation
Jednym z pierwszych komercyjnie dostępnych urządzeń dPCR był system dPCR BioMark™ HD (Fluidigm). Platforma ta oparta jest na technologii chipów mikroprzepływowych. Chipy można nabyć w różnych formatach, w tym w tablicach 12-komorowych lub 48-komorowych. W 12-komorowym układzie próbki są dzielone na 765 reakcji nanolitrowych, co daje 9 180 reakcji na chip. Układ 45-komorowy dzieli próbki na 770 reakcji nanolitrowych, co daje 36 960 reakcji na chip. Próbki są ładowane do każdego wlotu komory, a reakcje nanolitrowe są dzielone za pomocą zaworów i pomp sterowanych ciśnieniem. Podział i mieszanie próbek, a także reakcje termocyklingu są wykonywane na chipie. Po amplifikacji obrazy fluorescencyjne są rejestrowane za pomocą systemu BioMark8. Przetwarzanie na chipie pozwala na mniej ręcznych manipulacji, zmniejszając w ten sposób potencjalne wprowadzenie błędu przy zachowaniu bardziej uproszczonego, przyjaznego dla użytkownika systemu.
System dPCR firmy Fluidigm umożliwia multipleksowanie reakcji przy użyciu czterech celów na próbkę. Fluorescencyjny obraz chipa jest wykonywany przed i po każdej rundzie termocyklingu. Pozwala to na odjęcie wszelkiego tła przed cyklem termicznym od końcowego obrazu fluorescencyjnego, ułatwiając dokładne zliczanie dodatnich przedziałów. Kolejną cechą systemu jest możliwość ilościowego określenia matrycy, która jest podzielona na każdą komorę przy użyciu specyficznych dla komory wykresów amplifikacji w czasie rzeczywistym. W przypadku, gdy dPCR nie jest jedyną aplikacją używaną w laboratorium, BioMark™ HD działa również jako urządzenie kompatybilne z qPCR9,10,11.
Life Technologies
Systemy OpenArray® i QuantStudio® 12K Flex dPCR (Life Technologies) wykorzystują technologię mikroprzepływową do generowania i analizy próbek podzielonych na partycje. System OpenArray został opracowany jako pierwszy i może pomieścić do 3 płytek dPCR. Urządzenie QuantStudio 12K Flex dPCR może pomieścić do 4 płytek dPCR. Każda płytka 384-dołkowa ma 48 macierzy. W każdej macierzy znajdują się 64 "otwory przelotowe", co daje 3072 reakcje podzielone na przedziały na płytkę. Reakcje nanolitrowe są dzielone na "otwory przelotowe" za pomocą zautomatyzowanego systemu dozowania i są tam stabilizowane przez hydrofobowe i hydrofilowe interakcje między kroplą a powłoką na płytce. Platforma ta może być wykorzystywana do reakcji multipleksowych zawierających dwa cele na próbkę. Wszechstronność tego urządzenia sprawia, że jest ono kompatybilne z zastosowaniami qPCR12.
RainDance Technologies
Instrument RainDrop™ (RainDance Technologies) reprezentuje kolejną wysoce czułą platformę dPCR. Wzrost czułości i mocy ilościowej można przypisać mniejszym, pikolitrowym reakcjom i liczbie podzielonych kropelek; około 10 milionów kropelek na próbkę. RainDrop dPCR opiera się na technologii mikroprzepływowej emulsyfikacji kropli. Chipy są zaprojektowane tak, aby pomieścić 8 próbek, a każda próbka jest podzielona na 10 milionów reakcji, co daje 80 milionów podzielonych reakcji na chip. Ze względu na zwiększoną liczbę partycji reakcji, można uwzględnić więcej wejściowego DNA, dzięki czemu platforma ta jest idealna do identyfikacji niezwykle rzadkich mutacji. Zgodnie ze zwiększoną liczbą reakcji, ograniczenie rozcieńczenia wejściowego DNA staje się mniejszym problemem w przypadku tego urządzenia. Co więcej, raporty wskazują, że system RainDrop™ może być wykorzystywany do ilościowego oznaczania 1 na 200 000 mutacji i ma dolną granicę wykrywalności 1 na 1 000 000. Obserwacje te podkreślają czułość tego instrumentu13. Oprócz zwiększonej czułości, platforma RainDrop™ może multipleksować 5 celów na próbkę, po prostu używając czerwonych i zielonych znakowanych sond fluorescencyjnych. Zmiana ilości sondy fluorescencyjnej z każdym celem generuje unikalną intensywność koloru, która odpowiada specyficznej dla mutacji podwójnie znakowanej sondzie (patrz Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods), a intensywność jest bezpośrednio związana ze stężeniem sondy użytej w teście. Technika rozcieńczania sond fluorescencyjnych w celu wygenerowania kodu optycznego może nie ograniczać się do systemu multipleksowego 5×, ale może być stosowana do generowania systemu multipleksowego 10×, co czyni go jednym z najpotężniejszych dostępnych systemów multipleksowania dPCR14,15.
Chociaż RainDrop™ jest jedną z najbardziej efektywnych kosztowo platform, nie może być używana do zastosowań qPCR. Ponadto konfiguracja jest bardziej pracochłonna, a zatem może być bardziej podatna na wprowadzanie błędów. Na przykład, kropelki są generowane w chipie mikroprzepływowym, zbierane, a następnie termocykling jest wykonywany poza chipem. Reakcja jest następnie wstrzykiwana do innego układu w celu analizy. Podczas multipleksowania próbek, kropelki zawierające rozcieńczone sondy fluorescencyjne są zbierane z jednego chipa i wstrzykiwane do innego chipa, gdzie są łączone z kropelkami zawierającymi startery, mieszaninę wzorcową i DNA. Połączone kropelki są amplifikowane poza chipem, a następnie analizowane pod kątem obecności lub braku pożądanych celów15.
Bio-Rad
Technologia Bio-Rad QX100™ Droplet Digital™ PCR jest jedyną platformą, która nie wykorzystuje chipów mikroprzepływowych na żadnym etapie procesu. Zamiast tego, urządzenie to wykorzystuje technologię emulsyfikacji oleju w standardowym formacie płytki 96-dołkowej. Osiem próbek zawierających mieszaninę wzorcową, startery, podwójnie znakowane sondy i DNA można załadować do kasety w tym samym czasie. Każda próbka jest umieszczana w sąsiedztwie studzienki zawierającej olej i razem są poddawane emulsyfikacji kropelkowej przy użyciu generatora kropelkowego opartego na podciśnieniu. Każda próbka jest dzielona na 20 000 reakcji. Kropelki są przenoszone z kasety z 8 próbkami do standardowej płytki 96-dołkowej. Do analizy dPCR można wygenerować łącznie 1 920 000 kropelek na płytkę. Po przeniesieniu kropelek na 96-dołkową płytkę, próbki są amplifikowane przy użyciu PCR, a sygnały fluorescencyjne punktu końcowego są odczytywane za pomocą czytnika kropel opartego na cytometrii przepływowej16,9.
Większa liczba reakcji (20 000 na próbkę/1,9 miliona na płytkę) generowanych za pomocą tej platformy zwiększa
precyzję związaną z dPCR w określaniu bezwzględnej kwantyfikacji i pomiarów CNV. Zwiększona liczba reakcji na próbkę zapewnia możliwość załadowania większych ilości matrycowego DNA w porównaniu do innych systemów, które mają mniej podzielonych reakcji na próbkę. Staje się to coraz bardziej cenne przy wykrywaniu rzadkich, ważnych zdarzeń. Odczyty cyfrowe ze zduplikowanych studzienek mogą być również łączone w celu określenia CNV dla rzadkich lub niskokopijnych zdarzeń mutacyjnych. Dolne granice wykrywalności pozwalają na identyfikację 0,001% populacji mutantów w reakcjach partycjonowanych. Platforma QX100™ Droplet Digital™ PCR firmy Bio-Rad została również wykorzystana z DNA z osocza matki w celu określenia bezwzględnych pomiarów ilościowych markerów matczynych i płodowych, podkreślając zalety technologii dPCR w pomiarach CNV przy niskiej jakości/niskiej ilości matrycowego DNA17,16. Chociaż urządzenie QX100™ Droplet Digital™ PCR oferuje znaczną liczbę podzielonych reakcji na płytkę (1,9 miliona) i jest niedrogie, nie jest kompatybilne z aplikacjami qPCR i może być używane do multipleksowania tylko dwóch celów na próbkę.
Ograniczenia instrumentu
Cyfrowy PCR oferuje wiele zalet w porównaniu z qPCR. Zalety te są możliwe dzięki podziałowi poszczególnych reakcji, wzbogacając w ten sposób amplifikację niskich kopii i rzadkich alleli, jednocześnie zwiększając precyzję i moc kwantyfikacji dPCR w wyniku zwiększonej liczby reakcji w mikroskali. Metoda dPCR może być wykorzystywana nie tylko do pomiaru bezwzględnej liczby kopii, CNV i rzadkich mutacji allelicznych, ale może być również wykorzystywana do ilościowego oznaczania DNA o niskiej ilości/niskiej jakości6,16,18,13,19,5,17. Na przykład, podczas korzystania z sekwencjonowania następnej generacji, kwantyfikacja za pomocą dPCR może potencjalnie wyeliminować potrzebę i koszty przeprowadzania analiz miareczkowania na wejściowym DNA. To z kolei pozwala na wykorzystanie mniejszych ilości wejściowego DNA, minimalizując potrzebę pozornie stronniczego etapu wstępnej amplifikacji powszechnie stosowanego w sekwencjonowaniu nowej generacji7.
Mogą jednak wystąpić pewne przypadki, w których nie można uniknąć wstępnej amplifikacji. Podczas pracy z DNA z pojedynczej komórki lub gdy wejściowe DNA ma już niskie stężenie, może być wymagana amplifikacja całego genomu przed podzieleniem próbki na tysiące reakcji. Należy zauważyć, że wstępna amplifikacja docelowych próbek DNA może skutkować tendencyjną amplifikacją wejściowego DNA, co może potencjalnie zniekształcić wyniki dPCR. Konieczne może być zatem zbadanie, czy metoda zastosowana na tym etapie powoduje stronniczość amplifikacji przed oceną bezwzględnej liczby kopii9,11. Ponadto wykazano, że struktura DNA wpływa na pomiary liczby kopii w analizie dPCR. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku kolistylizowanego plazmidowego DNA, który powinien być linearyzowany przed użyciem w aplikacjach dPCR9.
Jedną z bardziej oczywistych wad dPCR jest początkowy koszt sprzętu i bieżące zapotrzebowanie na materiały eksploatacyjne. W związku z tym instrumenty qPCR są bardziej powszechne w warunkach laboratoryjnych, a naukowcy czują się bardziej komfortowo z obsługą tej platformy. Oczywiście pożądane zastosowania użytkownika ostatecznie zapewnią wytyczne dotyczące rodzaju urządzenia wymaganego do przeprowadzenia tych badań.
Zastosowania dPCR
Ponieważ próbki dPCR są dzielone na indywidualne mikroreaktory, liczba partycji określa zakres czułości wykrywania. Kwantyfikacja opiera się na zliczaniu liczby pozytywnych partycji w punkcie końcowym, w przeciwieństwie do cykli amplifikacji, a zatem nie zależy w dużym stopniu od wydajności amplifikacji. Aby uwzględnić losowy rozkład docelowego DNA na partycje, stosowany jest model statystyczny Poissona1 i obliczana jest ilość bezwzględna. Ilość sekwencji docelowej jest zwykle oceniana w porównaniu do sekwencji referencyjnej o znanej ilości w celu określenia względnej kwantyfikacji. Zastosowania bezwzględnej i względnej kwantyfikacji docelowego DNA obejmują pomiar CNV, analizę biomarkerów i wykrywanie rzadkich zdarzeń. Ponadto odwrotna transkrypcja może być połączona z dPCR w celu pomiaru cząsteczek RNA. Technika ta jest korzystna do ilościowego oznaczania niskich stężeń wirusa z kompleksu, transkrypcji w pojedynczych komórkach i transkrypcji specyficznej dla allelu.
CNV to nieprawidłowe kopie DNA spowodowane delecją, insercją lub rearanżacją i są związane z podatnością na choroby20,21,22. W nowotworach liczba kopii genów jest często zwiększona, a reaktywność pacjentów na leczenie farmakologiczne jest skorelowana z liczbą kopii23,24,25,26. Do ilościowej oceny CNV wykorzystano wiele metod, w tym tablice SNP, sekwencjonowanie nowej generacji i qPCR. Ostatnio dPCR stał się atrakcyjnym narzędziem do ilościowego określania biomarkerów pacjentów ze względu na większą precyzję w określaniu liczby kopii. Cyfrowa PCR została wykorzystana do dokładnego określenia CNV z rozdzielczością 1,25. Specyficzne sondy qPCR wzmocnione dodatkiem zasad LNA (patrz Metody ilościowego PCR i cyfrowego PCR) mogą być wykorzystywane w dPCR do rozróżniania i wykrywania obecności somatycznych wariantów SNP (Rysunek 4.1). Sondy są zaprojektowane w taki sposób, że sonda specyficzna dla mutacji zawiera fluorofor FAM, a druga sonda, specyficzna dla sekwencji typu dzikiego (WT), zawiera fluorofor HEX. Cele WT i SNP DNA są rozróżniane w teście. W niektórych przypadkach kopie genów mogą być "połączone" na tym samym allelu i w konsekwencji CNV może być niedoszacowana9. Duplikacja genów w tandemie może być rozwiązana przez trawienie matrycowego DNA specyficzną nukleazą restrykcyjną otaczającą sekwencję docelową16 (Rysunek 4.2).
Rysunek 4.1. Wykrywanie i określanie względnej liczby kopii mutacji SNP za pomocą Droplet Digital™ PCR. Przygotowano sondę specyficzną dla mutacji zawierającą barwnik fluorescencyjny FAM, a sonda dla sekwencji niezmodyfikowanej (typu dzikiego) zawierała fluorofor HEX. Oś X to sygnał HEX, generowany jako funkcja obecności sekwencji typu dzikiego. Oś Y to sygnał FAM, generowany jako funkcja obecności sekwencji mutacji SNP. W docelowym DNA wykryto zarówno sekwencje zmodyfikowane, jak i typu dzikiego, a względną liczebność każdej sekwencji można było bezpośrednio określić.
Rysunek 4.2. Test Droplet Digital™ PCR do określenia CNV. Oczyszczone, nietrawione DNA wykorzystano jako matrycę do ilościowego określenia liczby kopii genu w stosunku do odniesienia. Ta sama próbka DNA została również strawiona endonukleazą restrykcyjną otaczającą sekwencję docelową w celu wyjaśnienia połączonych kopii sekwencji docelowej. Pokazano słupki błędów Poissona.
Cyfrowa reakcja PCR jest stosowana do ilościowego oznaczania wariantów sekwencji DNA, które są obecne na tle obfitej sekwencji WT. Na przykład mutacje somatyczne, które są specyficzne dla nowotworów, mogą być wykrywane, gdy są obecne w tle normalnego genotypu w próbkach klinicznych. Ilościowy PCR jest ograniczony do wykrywania zmutowanych sekwencji obecnych w 1% lub więcej. Cyfrowa PCR zapewnia narzędzie do czułego wykrywania rzadkich kopii ze względu na rozcieńczający efekt podziału zmutowanego docelowego DNA od WT. Zakres dynamiczny kwantyfikacji zależy od ilości obecnego docelowego DNA i liczby ocenianych partycji. Dostępne instrumenty różnią się pod względem zalecanego zakresu dynamicznego. System Bio-Rad QX100™ Droplet Digital™ PCR został użyty do dokładnego wykrycia rzadkiego zmutowanego DNA ze 100 000-krotności WT16 a instrument RainDrop™ został użyty do wykrycia zmutowanej kopii z 200 000 kopii WT13. Typowa ocena zestawów starterów/sond do stosowania w wykrywaniu rzadkich zdarzeń polega na miareczkowaniu matrycowego DNA zawierającego SNP do matrycowego DNA WT, zmniejszając matrycę zawierającą SNP o połowę przy każdym rozcieńczeniu. Przykład takiego eksperymentu pokazano na Rysunku 4.3; pojedyncza studzienka pozwoliła na wykrycie, gdy częstotliwość zmutowanej sekwencji była tak niska, jak około 1 na 2000, podczas gdy dla porównania granica wykrywalności qPCR wynosiła 1 na 10. Granica wykrywalności dla dPCR może być dalej rozszerzana poprzez agregację danych w wielu studzienkach w celu zwiększenia liczby partycji bez zwiększania stężenia zawierającego SNP.
Ze względu na często ograniczoną ilość próbki DNA dostępnej do wykorzystania w sekwencjonowaniu nowej generacji, próbki są zazwyczaj amplifikowane metodą PCR lub amplifikacji całego genomu. Kwantyfikacja cząsteczek DNA po amplifikacji ma kluczowe znaczenie dla wydajności testu sekwencjonowania i może być przeprowadzona metodami takimi jak spektrofotometria. Niedawno zdolność dPCR do bezwzględnej kwantyfikacji DNA została zastosowana do przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji7. Opracowano uniwersalny test PCR z szablonową sondą fluorescencyjną, w którym sekwencja specyficzna dla sondy jest zaprojektowana na końcu jednego startera PCR do amplifikacji biblioteki27. Ten uniwersalny test oparty na sondzie matrycowej może być wykorzystywany w połączeniu z dPCR w celu dokładnego określenia ilościowego cząsteczek biblioteki.
Ekspresja genów kontrolujących aktywność komórkową, w tym różnicowanie komórek, różni się u poszczególnych członków populacji komórek, a pomiary całej populacji odzwierciedlają wartości średnie28. Chociaż preferowane może być mierzenie transkrypcji w pojedynczych komórkach, ilość obecnego RNA jest bardzo mała, tj. 1pg29. Regularny przepływ pracy dla analizy transkryptomu pojedynczej komórki przy użyciu qPCR wymaga etapu wstępnej amplifikacji w celu amplifikacji cDNA. Ze względu na zakres dynamiczny i zdolność do ilościowego oznaczania niskich stężeń matrycy, dPCR jest odpowiednią metodą analizy transkryptomu pojedynczej komórki bez użycia wstępnej amplifikacji.
Rysunek 4.3. Ocena zestawu primer/sonda w teście Droplet Digital™ PCR i qPCR do wykrywania rzadkich zdarzeń. Przygotowano sondę specyficzną dla mutacji zawierającą barwnik fluorescencyjny FAM, a sonda dla sekwencji niezmodyfikowanej (typu dzikiego) zawierała fluorofor HEX. Szablonowe DNA zawierające SNP miareczkowano do szablonowego DNA typu dzikiego, aby ocenić wykrycie mutacji SNP, gdy jest ona obecna w obfitym tle typu dzikiego. Szablon zawierający SNP był redukowany o połowę przy każdym rozcieńczeniu. A) Zestaw primer/sonda został użyty w qPCR z matrycą DNA miareczkowaną mutacją. B) Zestaw primer/sonda został użyty w pojedynczym dołku kropli dPCR z DNA miareczkowanym mutacją. Pokazano stosunek kopii mutacji do kopii typu dzikiego. Cyfrowa PCR pozwoliła na wykrycie, gdy częstotliwość występowania zmutowanej sekwencji była tak niska, jak około 1 na 2000, podczas gdy granica wykrywalności qPCR wynosiła 1 do 10. Granica wykrywalności dla dPCR może być dalej rozszerzana poprzez agregację danych w wielu studzienkach w celu zwiększenia liczby partycji.
Digital PCR MIQE
Wcześniej opublikowano "Minimalne informacje dotyczące publikacji eksperymentów ilościowego PCR w czasie rzeczywistym" (wytyczne MIQE30). (wytyczne MIQE30) zostały opublikowane w celu nakreślenia szczegółów projektu eksperymentalnego, które są sklasyfikowane jako niezbędne lub pożądane do publikacji wyników qPCR (patrz Quantitative PCR). Dodanie dPCR jako nowego narzędzia i wprowadzenie wielu instrumentów dPCR wymaga opracowania standardów MIQE specyficznych dla dPCR. Opublikowany standard Digital PCR MIQE (dMIQE) proponuje istotne i pożądane elementy, które należy wziąć pod uwagę w celu zapewnienia wiarygodności danych dPCR31. W wielu aspektach, w tym projektowania i optymalizacji starterów/sond, wymagania dla dPCR są podobne do qPCR.
Istnieją jednak właściwości, które są szczególnie istotne dla dPCR. Średnia liczba kopii na partycję i objętość partycji są zmienne, a wartości te są niezbędne do dokładnego zastosowania statystyki Poissona i dlatego powinny być zgłaszane. Należy również udokumentować liczbę partycji, z których pochodzą wyniki. Pożądane jest uwzględnienie wariancji objętości partycji i odchylenia standardowego, zgodnie z danymi dostarczonymi przez producenta urządzenia. Niezbędne jest uwzględnienie rodzaju i obróbki matrycowego DNA użytego w eksperymencie. Szablonowe DNA jest często wstępnie amplifikowane lub trawione enzymami restrykcyjnymi. Metody te i odpowiednie kontrole muszą zostać zgłoszone. Pożądane jest rejestrowanie eksperymentów optymalizacyjnych, takich jak gradient temperatury i określanie liczby cykli. Wymagana objętość próbki jest zmienna w zależności od urządzenia i dlatego jest odpowiednia i pożądana do uwzględnienia. We wszystkich opublikowanych raportach wymagane są pozytywne i negatywne kontrole reakcji oraz obliczona wariancja i przedziały ufności. Lista kontrolna dMIQE przedstawia te kwestie i oznacza każdą z nich jako niezbędną (E) lub pożądaną (D).
Ponieważ dPCR jest wciąż stosunkowo nową technologią, istnieje nadzieja, że wczesne przyjęcie wytycznych dMIQE zapobiegnie publikowaniu badań, które zostały przeprowadzone bez odpowiedniej jakości i kontroli naukowej.
Ponieważ dPCR jest wciąż stosunkowo nową technologią, istnieje nadzieja, że wczesne przyjęcie wytycznych dMIQE zapobiegnie publikowaniu badań, które zostały przeprowadzone bez odpowiedniej jakości i kontroli naukowej.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?