Protokół hodowli ludzkich preadipocytów (HPAd)

I. Przechowywanie

A. Fiolki kriokonserwowane (802s-05a, 802h-05a, S802s-05a)

Przechowywać fiolki kriokonserwowane w zbiorniku z ciekłym azotem natychmiast po ich dostarczeniu.

*Podczas wyjmowania fiolek kriokonserwowanych ze zbiornika z ciekłym azotem należy nosić maskę ochronną i rękawice. Gwałtowna zmiana temperatury między zbiornikiem a pomieszczeniem może spowodować pęknięcie uwięzionego w fiolkach ciekłego azotu i obrażenia.

Ludzkie preadipocyty (HPAd)

II. Przygotowanie do hodowli

1. Upewnij się, że szafka bezpieczeństwa biologicznego klasy II z laminarnym przepływem powietrza z filtrem HEPA jest w odpowiednim stanie technicznym.
2. Sterylizuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego 70% alkoholem.
3. Włącz dmuchawę szafki bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut przed rozpoczęciem pracy z hodowlą komórkową.
4. Upewnij się, że wszystkie pipety serologiczne, końcówki do pipet i roztwory odczynników są sterylne.
5. Przestrzegaj standardowej techniki sterylizacji i zasad bezpieczeństwa:
   a. Nie pipetować doustnie.
   b. Zawsze nosić rękawice i okulary ochronne podczas pracy z ludzkimi komórkami, nawet jeśli wszystkie szczepy zostały przebadane na obecność wirusa HIV, zapalenia wątroby typu B i zapalenia wątroby typu C.
   c. Wszystkie prace związane z hodowlą komórek należy wykonywać w sterylnym pomieszczeniu.

III. Hodowla HPAd

A. Przygotowanie kolb do hodowli komórkowej HPAd

1. Wyjmij z lodówki Human Preadipocyte Growth Medium (811-500). Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym kapturze.
2. Nanieść pipetą 15 ml Human Preadipocyte Growth Medium (811-500)* do kolby T-75 (SIAL0641).
   * Stosunek pożywki do powierzchni powinien wynosić 1 ml na 5 cm². -  5 ml dla kolby T-25 (SIAL0639) lub szalki do hodowli tkanek o średnicy 60 mm (SIAL0166).
   -  15 ml dla kolby T-75 (SIAL0641) lub naczynia do hodowli tkanek o średnicy 100 mm (SIAL0167).

B. Rozmrażanie i umieszczanie HPAd

1. Wyjmij kriokonserwowaną fiolkę HPAd ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu, stosując odpowiednią ochronę oczu i rąk.
2. Obróć nakrętkę fiolki o ćwierć obrotu, aby uwolnić ciekły azot, który może być uwięziony w gwintach, a następnie ponownie dokręć nakrętkę.
3. Szybko rozmroź komórki, umieszczając dolną połowę fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37°C i uważnie obserwuj fiolkę podczas procesu rozmrażania.
4. Wyjmij fiolkę z łaźni wodnej, gdy w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu. Nie pozwól na całkowite rozmrożenie komórek.
5. Odkaż zewnętrzną część fiolki 70% alkoholem w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Usuń ostrożnie korek fiolki. Nie dotykaj brzegu nakrętki ani fiolki rękami, aby uniknąć zanieczyszczenia.
7. Zawieś ponownie komórki w fiolce, delikatnie pipetując komórki 5 razy pipetą o pojemności 2 ml. Należy uważać, aby nie pipetować zbyt energicznie, aby nie spowodować pienienia.
8. Zmieszaj pipetą zawiesinę komórek (1 ml) z fiolki do kolby T-75 (SIAL0641) zawierającej 15 ml pożywki Human Preadipocyte Growth Medium (811-500).
9. Zamknąć kolbę i delikatnie wstrząsnąć, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
10. Umieścić kolbę T-75 (SIAL0641) w inkubatorze z nawilżaniem 37^oC, 5% CO₂ . Poluzuj pokrywę, aby umożliwić wymianę gazową. Aby uzyskać najlepsze wyniki, nie należy zakłócać hodowli przez 24 godziny po inokulacji.
11. Zmień na świeżą Human Preadipocyte Growth Medium (811-500) po 24 godzinach lub przez noc, aby usunąć wszelkie ślady DMSO.
12. Zmieniać Human Preadipocyte Growth Medium (811-500) co drugi dzień, aż komórki osiągną 60% konfluencji.
13. Podwoić objętość pożywki Human Preadipocyte Growth Medium (811-500), gdy hodowla osiągnie 60% konfluencji lub w przypadku karmienia weekendowego.
14. Podkulturuj komórki, gdy hodowla HPAd osiągnie 85-95% konfluencji.

IV. Podhodowla HPAd

A. Przygotowanie odczynników do podhodowli

1. Wyjmij Roztwór trypsyny-EDTA  (T3924) i Inhibitor trypsyny  (T6414) z zamrażarki o temperaturze -20°C i rozmroź przez noc w lodówce.
2. Upewnij się, że wszystkie odczynniki do podhodowli są rozmrożone. Delikatnie zawiruj każdą butelkę kilka razy, aby utworzyć jednorodne roztwory.
3. Przechowuj wszystkie odczynniki do podhodowli w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
4. Aliquot Trypsin/EDTA solution (T3924) i przechowuj niewykorzystaną część w temperaturze -20 °C, jeśli potrzebna jest tylko część Trypsin/EDTA (T3924).

B. Przygotowanie kolby hodowlanej

1. Wyjmij Human Preadipocyte Growth Medium (811-500) z lodówki. Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym pomieszczeniu.
2. Nanieść pipetą 35 ml Human Preadipocyte Growth Medium (811-500) do kolby T-175 (SIAL1080) (do użycia w Sekcji IV C Krok 15.)

C. Podhodowla HPAd

Trypsynuj komórki w temperaturze pokojowej. Nie podgrzewać żadnych odczynników do temperatury 37 °C.

1. Usuń pożywkę z kolb hodowlanych przez aspirację.
2. Umyj monowarstwę komórek za pomocą HBSS (H6648) i usuń roztwór przez aspirację.
3. Pobierz pipetą 6 ml roztworu trypsyny/EDTA (T3924) do kolby T-75 (SIAL0641). Delikatnie potrząśnij kolbą, aby upewnić się, że roztwór pokrywa wszystkie komórki.
4. Natychmiast usuń 5 ml roztworu.
5. Zamknij szczelnie kolbę i monitoruj postęp trypsynizacji w temperaturze pokojowej pod odwróconym mikroskopem. Zazwyczaj zaokrąglenie komórek zajmuje około 1 do 3 minut. Komórki mogą nie stać się całkowicie okrągłe podczas trypsynizacji, a niektóre komórki mogą zachować pewne procesy, nawet jeśli zostaną oderwane od powierzchni hodowli.
6. Uwolnij zaokrąglone komórki z powierzchni hodowli, uderzając bokiem kolby o dłoń, aż większość komórek zostanie odłączona.
7. Nanieś pipetą 5 ml roztworu inhibitora trypsyny (T6414) do kolby, aby zahamować dalszą aktywność tryptyczną.
8. Przenieść zawiesinę komórek z kolby do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
9. Przepłucz kolbę dodatkowymi 5 ml roztworu inhibitora trypsyny (T6414) i przenieś roztwór do tej samej probówki stożkowej.
10. Zbadaj kolbę T-75 (SIAL0641) pod mikroskopem. Jeśli w kolbie pozostało 20% komórek, powtórz kroki 2-9.
11. Wiruj probówkę stożkową z prędkością 220 x g przez 5 minut, aby osuszyć komórki.
12. Spuść supernatant z probówki bez naruszania osadu komórek.
13. Przesuń końcówkę stożkowej probówki palcem, aby poluzować osad komórek.
14. Zawieś ponownie komórki w 5 ml pożywki Human Preadipocyte Growth Medium  (811-500), delikatnie pipetując komórki w celu rozbicia grudek.
15. Zlicz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Zaszczepić 10 000 komórek na cm² dla szybkiego wzrostu lub 6 000 komórek na cm² dla regularnych subkultur.

V. Różnicowanie HPAd

A. Posiew HPAd w celu różnicowania

1. Dostosuj objętość Human Preadipocyte Growth Medium  (811-500), aby uzyskać pożądaną gęstość komórek
    zgodnie z poniższą tabelą:

Format hodowli	Powierzchnia/dołek	Gęstość komórek/mL	Objętość	# komórek na dołek	Objętość na format
6-dołkowa płytka	9Objętość na studzienkę	# komórek na studzienkę	Objętość na format
Płytka 6-studzienkowa	9.40 cm2	110,000	4 mL	440 000	24 mL
12-dołkowa płytka	3.83 cm2	90,000	2 mL	180 000	24 mL
24-dołkowa płytka	1.88 cm2	90,000	1 mL	90 000	24 mL
48-dołkowa płytka	0.86 cm2	84,000	500 µL	42 000	24 mL
96-dołkowa płytka	0.32 cm2	110,000	150 µL	16,500	14.4 mL
Kolba T-25	25 cm2	240,000	5 mL	1,200,000	5 mL
Kolba T-75	75 cm2	240 000	15 mL	3,600,000	15 mL

2. Posiać preadipocyty w ilości 44 000 komórek/cm² w pożądanym formacie do różnicowania.

3. Umieść komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C i 5% CO₂.

4. Rozpocznij różnicowanie, gdy hodowla osiągnie 100% konfluencji, a komórki będą upakowane. Zazwyczaj osiągnięcie całkowitej konfluencji zajmuje od 1 do 2 dni.

B. Przygotowanie pożywki do różnicowania

1. Wyjmij pożywkę do różnicowania ludzkich adipocytów (811D-250) z lodówki i odkaż butelkę 70% alkoholem w sterylnym pomieszczeniu.
2. Nałóż wymaganą ilość Human Adipocyte Differentiation Medium (811D-250), odkręć nakrętkę i wyrównaj temperaturę w 37°C, 5% CO₂ nawilżanym inkubatorze przez 2 godziny, aby umożliwić wymianę gazową i ogrzanie się pożywki do 37°C.

C. Różnicowanie HPAd do HAd

Nie pozwól komórkom wyschnąć podczas zmiany pożywki.

HPAd musi być w 100% konfluentny, a komórki zapakowane przed rozpoczęciem różnicowania

1. Usuń pożywkę z kolby hodowlanej przez aspirację.
2. Dodaj odpowiednią objętość Human Adipocyte Differentiation Medium  (811D-250) zgodnie z tabelą w sekcji V. A. Krok 1.
3. Inkubuj komórki w 37°C, 5% CO₂ nawilżanym inkubatorze w pożywce do różnicowania ludzkich adipocytów (811D-250).
4. Zmieniaj na świeże Human Adipocyte Differentiation Medium (811D-250) co 3 dni przez 15 dni.
5. Pod koniec 15 dni komórki różnicują się w HAd z kropelkami lipidów w komórkach.
6. Usuń  Human Adipocyte Differentiation Medium (811D-500) i zagłodź komórki w  Human Adipocyte Starvation Medium (811S-250) na 1 dzień przed testem.

.