235419

Zestaw do badania aktywności komórkowej kaspazy-3

• NACRES: NA.54
• UNSPSC Code: 41116133

Właściwości

• usage: sufficient for 96 tests
• Quality Segment: 100
• species reactivity (predicted by homology): mammals
• packaging: pkg of 1 96-well plate(s)
• manufacturer/tradename: Calbiochem^®
• storage condition: OK to freeze, avoid repeated freeze/thaw cycles
• input: sample type cell extract(s)
• detection method: colorimetric, fluorometric
• storage temp.: −70°C

Opis

General description

Kaspaza-3 (znana również jako CPP32, apopain i Yama), członek rodziny proteaz cysteinowych konwertujących interleukinę-1β (ICE), składa się z podjednostek o masie 17 i 12 kDa pochodzących od wspólnego proenzymu, pro-kaspazy-3. Jest ona aktywowana podczas apoptotycznych zdarzeń sygnalizacyjnych przez wcześniejsze proteazy, w tym kaspazę-6, kaspazę-8 (FLICE) i cytotoksyczny granzym B pochodzący z komórek T. Kaspaza-3 jest jedną z głównych kaspaz występujących w komórkach apoptotycznych. Cele rozszczepienia kaspazy-3 obejmują polimerazę poli(ADP-rybozy) (PARP), laminy jądrowe, gelsolinę i inne. Kaspaza-3 jest potencjalnym celem terapeutycznym.

Wygodny zestaw testowy przydatny do pomiaru aktywności kaspazy-3 i kaspazy-3-podobnej w ekstraktach komórkowych przy użyciu substratu kolorymetrycznego lub fluorometrycznego. Dostarczany w wygodnym 96-dołkowym formacie ze wszystkimi odczynnikami niezbędnymi do przygotowania ekstraktów komórkowych, pomiaru aktywności kaspaz i kalibracji testu. Dodatkowo, kaspaza-3 jest dołączona do użytku jako kontrola pozytywna, do testowania ekstraktów komórkowych pod kątem endogennych inhibitorów lub do porównywania wpływu egzogennych inhibitorów na aktywność komórkową z aktywnością oczyszczonego enzymu.

Biochem/physiol Actions

Szeroki zakres gatunków

Features and Benefits

Czas testu: 2,5-3 h

Preparation Note

Przygotowanie ekstraktów komórkowych1. Wyhodować kultury komórkowe i indukować apoptozę zgodnie z życzeniem przy użyciu odpowiedniego czynnika. Odpowiednie kontrole mogą obejmować nietraktowane komórki, komórki traktowane nieaktywnym analogiem chemicznym induktora apoptozy lub po prostu próbkę "czas zero" z przebiegu czasowego indukcji apoptozy. Liczba komórek wymaganych do eksperymentu musi zostać określona przez użytkownika. Do oznaczenia aktywności kaspazy-3 potrzebna jest wystarczająca ilość komórek oraz dodatkowy materiał do określenia stężenia białka (w razie potrzeby).Jako wskazówka, oto przykład danych uzyskanych z komórek U937: - Stężenie białka = 1 - 3 mg/ml [gęstość komórek (przy lizie) = ~2 x¹⁰⁷ komórek/ml] - 10 µl próbki testowej = 10-30 µg białka (lub ~2 x¹⁰⁵ komórek)- Testy rozszczepiania DEVD-pNA: 10 ml próbek; 37°C; A405 po 30 min. - Komórki kontrolne = 0,004, komórki apoptotyczne = 0,22. Pożądane jest posiadanie wystarczającej ilości ekstraktu do przeprowadzenia podwójnych testów, z kontrolą traktowaną inhibitorem i bez niej, oraz określenia stężenia białka. Dlatego w przypadku komórek U937 sugeruje się co najmniej¹⁰⁶ komórek w 50 µl dla każdego warunku testowego. Inne typy komórek mogą mieć inne wymagania.2. Policzyć komórki i zebrać je przez odwirowanie (np.: 1000 x g, 4°C, 10 min). Przepłucz komórki raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Jeśli komórki zostały potraktowane odczynnikiem, który może zakłócać późniejszy test kaspaz (np. potencjalnym inhibitorem kaspaz), może być pożądane dokładniejsze przepłukanie komórek przed lizą.3. Zawiesić komórki do pożądanego stężenia (np.: 2 x^107/ml) za pomocą lodowatego buforu do lizy komórek. Inkubować przez 5 minut na lodzie. Jeśli liza komórek jest niekompletna, do buforu do lizy komórek można dodać dodatkowy detergent, aby wspomóc rozpuszczanie/destabilizację błon. Dodanie detergentu TWEEN^®-20(nr kat. 655205 lub 655206), NP-40 (nr kat. 492015 lub 492017) lub detergentu TRITON X-100 (nr kat. 648462 lub 648463) do końcowego stężenia 0,1% jest zgodne z późniejszym testem kaspaz.4. Wirować z prędkością 10 000 x g, 10 minut w temperaturze 4°C.5. Zachować supernatant (cytozol) i przechowywać w łaźni lodowej do czasu użycia. Alternatywnie, ekstrakty można szybko zamrozić i przechowywać w temperaturze -70°C do późniejszego wykorzystania. Aby zapewnić najwyższą stabilność, wszystkie odczynniki należy przechowywać w temperaturze -70°C. Płytkę należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Z kaspazą-3 należy obchodzić się szczególnie ostrożnie w temperaturze pokojowej, aby zachować jej maksymalną aktywność enzymatyczną. Należy ją szybko rozmrozić w łaźni wodnej lub pocierając palcami, a następnie natychmiast przechowywać w łaźni lodowej. Niewykorzystany enzym należy szybko ponownie zamrozić w temperaturze -70°C. Aby zminimalizować degradację i utratę aktywności enzymu, podziel kaspazę-3 na kilka probówek i przechowuj w temperaturze -70°C.

Po dostarczeniu przechowywać płytkę o objętości 1/2 w temperaturze pokojowej, a pozostałe składniki zestawu w temperaturze -70°C.

Analysis Note

1. Wykreślić dane jako _A405 lub arbitralne jednostki fluorescencji (AFU) w funkcji czasu dla każdej próbki. 2. Dla każdej próbki określić długość początkowego okresu czasu, w którym wykres absorbancji (lub AFU) w funkcji czasu pozostaje liniowy i występuje wystarczająca zmiana absorbancji (lub zmiana AFU), aby uzyskać dokładne nachylenie. Początkowe stężenie substratu (200 µM DEVD-pNA) jest nasycone. W przypadku wielu próbek szybkość rozszczepiania DEVD-pNA pozostanie stała przez co najmniej 2 godz. Jednak próbki o wysokiej aktywności mogą zmniejszyć stężenie substratu do poziomu poniżej nasycenia w znacznie krótszym czasie. W takich przypadkach należy wybrać dane z wcześniejszej, liniowej części przebiegu czasowego do wykorzystania w obliczeniach nachylenia w kroku 3. (Przykładem mogą być dane "Etop.-4" na Rys. 2). Ponieważ substrat AMC jest stosowany w stężeniu poniżej nasycenia (30 µM), należy zachować szczególną ostrożność przy wyborze danych, które mieszczą się w liniowej części krzywej postępu reakcji.3. Uzyskać nachylenie linii, dopasowanej do liniowej części danych, przy użyciu odpowiedniego programu regresji liniowej.4. Uśrednić nachylenia replikowanych próbek.ANALIZA DANYCH (pod względem konwersji substratu)5. Jeśli ślepa próba ma znaczące nachylenie, odejmij tę liczbę od wszystkich próbek. W normalnych warunkach nie będzie to konieczne, ponieważ nachylenie będzie bliskie zeru.6. Obliczenia aktywności specyficznej a) Aby znormalizować aktywność w odniesieniu do liczby komórek, należy podzielić wartości obliczone w kroku 6 przez liczbę komórek zawieszonych w 10 µl buforu lizującego. (patrz Metody eksperymentalne, kroki 1-3): Aktywność właściwa (pmol/min/liczba komórek) = aktywność (pmol/min)/liczba komórek na studzienkęb) Aby obliczyć aktywność właściwą w odniesieniu do białka całkowitego, określ zawartość białka w każdym ekstrakcie komórkowym. Podzielić aktywność przez zawartość białka w odpowiedniej próbce (patrz rysunki 2 i 3):Aktywność właściwa = pmol/min/mg białkaUwaga: Bufor do lizy komórek jest kompatybilny z wiązaniem barwnika Coomassie (Bradford) i testami białkowymi opartymi na kwasie dwuchoninowym (BCA) w odpowiednich warunkach. W przypadku testu BCA próbki ekstraktu komórkowego należy rozcieńczyć ≥ 10-krotnie w wodzie. Testy BCA mogą wykazywać zwiększone tło ze względu na zwiększone stężenie DTT. Ekstrakty komórkowe rozcieńczone >10-krotnie wodą są uważane za zgodne. Upewnij się, że używasz buforu do lizy komórek w standardach i utrzymuj równe ilości we wszystkich próbkach. Uwaga dotycząca standardu kalibracji AMC: Dokładny zakres stężeń AMC, który będzie przydatny do przygotowania krzywej wzorcowej, będzie się różnić w zależności od modelu fluorymetru, ustawienia wzmocnienia oraz dokładnych długości fal wzbudzenia i emisji. Dostarczony wzorzec AMC (30 µM) może w niektórych przypadkach dawać odczyty poza skalą. Zalecamy rozcieńczenie części wzorca do stosunkowo niskiego stężenia za pomocą buforu testowego (0,5 lub 1,0 µM), a następnie zmierzenie fluorescencji 100 µl. Oszacowanie AFU/µM uzyskane z tego pomiaru, wraz z obserwowanym zakresem wartości uzyskanych w testach enzymatycznych, może być następnie wykorzystane do zaplanowania odpowiedniej serii rozcieńczeń dla krzywej standardowej.

Other Notes

Thornberry, N.A., i Lazebnik, Y. 1998. Science 281, 1312.
Faleiro, L., et al. 1997. EMBO J.16, 2271.
Kothakota, S., et al. 1997. Science278, 294.
Nicholson, D.W. 1996. Nat. Biotechnol. 14, 297.
Schlegel, J., et al. 1996. J. Biol. Chem. 271, 1841.
Srinivasula, S.M., et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14486.
Nicholson, D.W., et al. 1995. Nature 376, 37.
Tewari, M., et al. 1995. Cell 81, 801.
Fernandes-Alnemi, T., et al. 1994. J.Biol. Chem.269, 30761.

Ze względu na charakter materiałów niebezpiecznych w tej przesyłce, do zamówienia mogą zostać doliczone dodatkowe opłaty za wysyłkę. Niektóre rozmiary mogą być zwolnione z dodatkowych opłat za wysyłkę materiałów niebezpiecznych. Aby uzyskać więcej informacji na temat tych opłat, należy skontaktować się z lokalnym biurem sprzedaży.

Human Recombinant Caspase-3, Cell Lysis Buffer, a DEVD-pNA Colorimetric Substrate, Ac-DEVD-AMC Fluorometric Substrate, Calibration Standard (p-Nitroaniline), AMC Calibration Standard, an Inhibitor, Assay Buffer, one half-volume 96-Well Plate, and a user protocol.

Legal Information

CALBIOCHEM is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

TWEEN is a registered trademark of Croda International PLC

Disclaimer

Toksyczność: Wiele wartości toksyczności, patrz MSDS (O)

Ta strona może zawierać tekst przetłumaczony maszynowo.

Informacja o środkach bezpieczeństwa

• Klasa składowania: 12 - Non Combustible Liquids
• flash_point_f: Not applicable
• flash_point_c: Not applicable