Estrategias de fabricación de vacunas y tratamiento con ARNm

El rápido desarrollo y éxito de las vacunas COVID-19 demuestra el poder del ARNm, pero su potencial va mucho más allá de esta aplicación: la tecnología de ARNm encierra una promesa apasionante para abordar necesidades médicas no cubiertas y ofrece nuevas opciones terapéuticas en la lucha contra el cáncer, las cardiopatías o las enfermedades infecciosas. 

La introducción de ARNm en el citosol de una célula paciente puede inducir la producción de una proteína específica que funcione como terapéutica o profiláctica, actuar como antígeno para desencadenar una respuesta inmunitaria con fines de vacunación, sustituir una proteína defectuosa o activar una respuesta antitumoral.

A diferencia de los sistemas de administración vírica, como los vectores de virus adenoasociados (AAV), muy utilizados en vacunas y genoterapias, los sistemas de administración no vírica, como la tecnología de ARNm, ofrecen múltiples ventajas: un mejor perfil de seguridad, un alto grado de versatilidad y una fabricación simplificada mediante un proceso basado en plantillas. Los científicos de desarrollo se dedican a mejorar la estabilidad, la traducción y la seguridad del ARNm optimizando los procesos y las plataformas de administración.

Vea todos nuestros productos y servicios para el desarrollo y la fabricación de ARNm.

Más información sobre

• Consideraciones para la producción de ARNm
• ARNm: Elementos estructurales y su función
• Producción de ARNm
• Purificación del ARNm
• Formulación del ARNm
• Consideraciones sobre el escalado
• ARNm: Un futuro brillante
• Productos relacionados

Consideraciones para la producción de ARNm

El desarrollo y la producción de vacunas y tratamientos de ARNm son comparativamente sencillos, escalables y extremadamente rápidos (Figura 1). Con un marco temporal reducido desde la fase de desarrollo hasta la fase clínica, y su aprobación, la tecnología del ARNm es atractiva no sólo como una respuesta rápida y eficaz a a brotes de enfermedades infecciosas, sino también para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos destinados a abordar enfermedades con necesidades insatisfechas.

El ARNm se produce mediante síntesis in vitro a través de un proceso enzimático. A diferencia de la clásica expresión proteica in vivo, no se precisan las laboriosas etapas de clonación y amplificación, ni la eliminación de células y proteínas de las células anfitrionas. En este proceso de fabricación simplificado se demuestra una velocidad y flexibilidad notables, ya que se utilizan los mismos materiales de reacción y recipientes para cualquier objetivo que permita que las instalaciones GMP cambien a una nueva diana proteica en muy poco tiempo, con una adaptación mínima al proceso y la formulación.

Figura 1. Descripción general del proceso de producción de ARNm.

Hay varias consideraciones clave que deben tenerse en cuenta para optimizar el proceso, el rendimiento, la calidad y la inocuidad del producto final. Entre ellas, se cuentan, por ejemplo, la selección de los productos químicos de proceso y las materias primas adecuados. En especial durante la transcripción in vitro y la purificación posterior, el ARNm está desprotegido lo que implica un gran riesgo de degradación enzimática. El uso de productos con ausencia de actividad endonucleasa probada minimiza el riesgo de degradación inducida por la ARNasa en todo el proceso, desde la producción hasta la purificación y la formulación del ARNm. Para controlar el riesgo de contaminación microbiana y por endotoxinas, es importante también utilizar productos con bajas concentraciones microbianas y de endotoxinas específicas. Esto es especialmente crucial para aplicaciones de alto riesgo como los inyectables, debido a la mayor posibilidad de que los microbios contaminantes causen daños.

Esta página web está dedicada al ARNm y proporciona información detallada sobre la selección de tecnologías y productos, ayudándole a navegar con confianza por el proceso de ARNm desde la producción hasta el llenado final. Para ayudarle a tomar decisiones informadas, le ofrecemos información detallada sobre productos, servicios y experiencia en nuestros folletos "Capacidades y soluciones para todas las plataformas de ARNm" y "Productos químicos de proceso para la fabricación de ARNm terapéutico".

ARNm: ELEMENTOS ESTRUCTURALES Y SU FUNCIÓN

La construcción del ARNm está diseñada para garantizar la expresión eficiente del gen de interés. La estabilidad, la expresión génica y la traducción eficaz de las proteínas dependen de varios elementos estructurales (Figura 2):

Figura 2. Estructura del ARNm.

• Región de la caperuza en el extremo 5' de la secuencia: esencial para la maduración del ARNm, su reconocimiento por el ribosoma para una traducción proteica eficaz y su protección frente a la digestión por nucleasas para mejorar su estabilidad.
• Regiones no traducidas (UTR) en los dominios anterior y posterior de la región codificadora del ARNm: regulan la traducción, la localización y la estabilidad del ARNm; pueden utilizarse para mejorar la eficacia de la expresión proteica.
• Regiones del marco de lectura abierto o secuencia codificadora: contiene el gen de interés (GOI).
• Cola poli(A): crucial para la traducción de proteínas y la estabilidad del ARNm al impedir la digestión por la 3' exonucleasa.

Producción del ARNm

La producción de tratamientos y vacunas de ARNm comienza, como se muestra en la Figura 1, con una plantilla de ADN plasmídico (ADNp) que luego se linealiza y transcribe a ARN:

• Producción del ADNp: la plantilla de ADNp contiene un promotor de la ARN polimerasa dependiente de ADN y la secuencia correspondiente para la construcción del ARNm. Dado el papel central del ADNp, su diseño y pureza son factores importantes para optimizar el ARNm producido. El ADNp requerido se amplifica dentro de células bacterianas, normalmente E. coli, y los pasos de purificación posteriores producen un ADNp circular, puro, concentrado. Las estrategias para superar los retos derivados del gran tamaño del ácido nucleico y su gran viscosidad, la sensibilidad a las fuerzas mecánicas y las semejanzas entre el ADNp y las impurezas se tratan en profundidad en nuestra publicación "Designing a Plasmid DNA Downstream Purification Process".

• Linealización del ADNp: el ADNp circular se linealiza utilizando una enzima de restricción en un tampón de reacción¹ para que sirva de plantilla a la ARN polimerasa para transcribir el ARNm deseado. La linealización es necesaria para evitar eventos de ultralectura de transcripción que puedan generar formas no deseadas del ARNm y producir impurezas añadidas que tendrían que eliminarse.

• Purificación del ADNp: se eliminan impurezas como la enzima de restricción, la seroalbúmina bovina (BSA), los fragmentos de ADN, las endotoxinas y otras. En la mayoría de los procesos a escala de laboratorio se utilizan técnicas de extracción con disolventes que no son adecuadas para entornos de producción conformes a las GMP. Como alternativa, la filtración de flujo tangencial (TFF) y la cromatografía son técnicas eficaces de eliminación de impurezas para esta etapa de purificación. Se han identificado las endotoxinas como una impureza crucial en el proceso de fabricación del ADNp que tienen un gran impacto en los pasos posteriores del proceso y, en última instancia, en la seguridad del paciente. Para eliminar las endotoxinas pueden utilizarse detergentes, por ejemplo, el detergente Deviron^® C16, como una alternativa a los detergentes tradicionales sostenible, biodegradable y conforme a REACH.²

Encontrará más información sobre la producción y la purificación de ADNp en nuestro artículo técnico especializado.

• Transcripción in vitro (IVT): el ADNp linealizado, que sirve como plantilla para el ADN, se transcribe en ARNm en una reacción enzimática en la que se utilizan elementos del proceso de transcripción natural. Los componentes cruciales de la transcripción in vitro son la ARN polimerasa para transcribir la secuencia de ADN en una secuencia de ARN, los trifosfato de nucleósido (NTP) como unidades estructurales del ARNm, la pirofosfatasa inorgánica (IPP) para mejorar el rendimiento del ARNm y los inhibidores de la ARNasa para evitar la degradación del ARN. En el tampón de transcripción suelen incluirse sustancias químicas como el ditiotreitol (DTT; un reductor de los enlaces disulfuro que inhibe la actividad de la ARNasa, favoreciendo así la estabilidad del ARNm) y la espermidina (un componente que mejora la eficacia de la transcripción y la estabilidad de los ácidos nucleicos).
  Para supervisar las reacciones enzimáticas, como en la etapa de IVT, podría utilizarse la espectroscopia Raman, una potente herramienta analítica, . Hasta ahora, se vienen realizando tediosos análisis fuera de línea para supervisar la etapa IVT, lo que no permite una actuación inmediata en el caso de que no cumplan las condiciones de reacción o los objetivos de productividad. Este problema podría resolverse con la espectroscopia Raman, que permite mediciones mucho más rápidas de los CPP y los CQA, y da a los operarios la posibilidad de tomar con mayor rapidez decisiones para garantizar unas condiciones de proceso óptimas.

• Protección con caperuza: después de la transcripción, la estructura de ARNm final requiere una caperuza en 5’ para su estabilidad y su transducción eficiente a la célula. La caperuza puede añadirse de dos formas, a la vez que la transcripción (cotranscripcional) o después de la transcripción (postranscripcional) mediante un proceso enzimático de dos pasos.
  En la formación cotranscripcional de la caperuza suelen utilizarse análogos de la caperuza y trifosfato de guanosina (GTP) en la mezcla de transcripción, añadidos en una proporción de cuatro análogos de caperuza por un GTP. La formación cotranscripcional de la caperuza es menos costosa y más rápida que la enzimática, ya que se realiza durante la fase de IVT, en la misma mezcla del reactor. Sin embargo, la eficacia y el rendimiento son menores, y puede generar impurezas sin caperuza debido a una unión incorrecta o a una incorporación inversa. Para evitar la incorporación inversa de la caperuza 5', se han desarrollado algunos análogos de caperuza anti-inversa (ARCA), lo que aumenta la eficiencia de la traducción.
  La incorporación enzimática de la caperuza (o postraduccional) se realiza in vitro tras la purificación del ARNm a partir de la mezcla de transcripción. En esta reacción se utiliza en general una enzima que protege al virus de la vaccinia para añadir la caperuza a la estructura del ARNm. Si bien la eficiencia de este proceso de colocación enzimática de la caperuza al ARNm es muy elevada, es más costosa y requiere una operación extra.

Estos pasos del proceso van seguidos de la purificación y la formulación del ARNm para producir el medicamento final.

PURIFICACIÓN DEL ARNm

Después de la etapa de transcripción in vitro, el ARNm se purifica de las impurezas y los materiales utilizados en los pasos anteriores, como las endotoxinas, el ARN bicatenario (dsRNA) inmunógeno, la plantilla de ADN residual, la ARN polimerasa y las impurezas elementales. En esta etapa, el ARNm tendrá que estar en la disolución tampón adecuada para los pasos de TFF, colocación enzimática de la caperuza o cromatografía. Existen varias opciones para la   purificación del ARNm y la eliminación del ADN residual:

• la filtración por flujo tangencial (TFF) se utiliza para una separación eficaz entre el ARNm y las impurezas menores que no son retenidas por la membrana. Normalmente la plantilla de ADN se degrada mediante la adición de ADNasas y los pequeños fragmentos de ADN resultantes pueden separarse fácilmente de las moléculas de ARNm más grandes utilizando TFF. En función del tamaño del ARNm, pueden utilizarse valores de corte de peso molecular de 30 a 300 kDa. Con la TFF es posible purificar, concentrar y diafiltrar el producto en la misma operación. Sin embargo, fragmentos pequeños de ADN pueden hibridar con el ARNm y generar otras impurezas, lo que se evita si se utiliza la captura para eliminar la plantilla de ADN.³ 


• Técnicas de cromatografía, como la cromatografía de par iónico en fase inversa (IPRP), la de intercambio aniónico (AEX) y la cromatografía de afinidad (AC) utilizando captura de poli(dT) (Figura 3), proporcionan un medio eficaz para retirar la plantilla de ADN, eliminar la necesidad de digestión de la plantilla de ADN y el riesgo de hibridación que puede surgir durante los pasos de ultrafiltración/diafiltración.¹ Para eliminar productos no deseados y las impurezas de oligonucleótidos, se utiliza también la cromatografía después del paso de la coloración enzimática de la caperuza. Sin embargo, es más caro y aún se necesitaría una etapa de TFF para el cambio de medios y la preparación de la etapa siguiente.

Figura 3: Comparación de la cromatografía de par iónico en fase inversa, la cromatografía de intercambio aniónico y la cromatografía de afinidad para la purificación de ARNm. (DBC: capacidad de unión dinámica).^4,5

• La cromatografía de par iónico en fase inversa suele utilizarse a escalas pequeñas y permite una purificación muy eficiente y rápida del ARN, así como una buena separación entre el ARN monocatenario (ssRNA) y el ADN, el ARN bicatenario (dsRNA) y los trascritos cortos. Las desventajas de este método abarcan el uso de disolventes que afectan a la idoneidad para la fabricación según las GMP, la complejación del ARNm por reactivos de par iónico que requiere pasos de diafiltración para la eliminación de los complejos y su sensibilidad a la contaminación por proteínas y agregados, lo que hace que esta técnica sea más adecuada para purificar que para capturar.


• La cromatografía de intercambio aniónico (AEX) tiene una gran capacidad de unión dinámica, de >10 mg de ARN/ml, y elimina con gran eficacia impurezas inmunógenas como el ARN bicatenario, el ARN sin caperuza, los híbridos ARN-ADN y otras estructuras de ARN como las horquillas en el ARNm. Si bien la AEX permite el uso de disoluciones acuosas, podría requerir la adición de agentes caotrópicos que pueden ser tóxicos y necesitar temperaturas de hasta 85 ° C para la desabsorción de grandes moléculas de ARNm unidas a la resina. La elución a temperatura ambiente suele aplicarse a especies de ARNm < 500 bases.⁵


• Para capturar la poli(dT) en cromatografía de afinidad (AC) se utiliza una resina que captura específicamente la cola de poli(A) de transcritos de ARNm de longitud completa. Este proceso elimina con eficiencia el ADN, los nucleótidos, las enzimas, los componentes amortiguadores y cualquier otra impureza que no tenga una cola de poli(A). Igual que la AEX, permite el uso de disoluciones acuosas. En el caso de la AC, normalmente un gradiente salino. A diferencia de la IPRP y la AEX, la AC no puede discriminar el ARN bicatenario del monocatenario, y no elimina con eficacia otras impurezas relacionadas con el producto, como los fragmentos de ADN que hayan hibridado con el ARNm. Por esta razón, un enfoque común consiste en aplicar AC como paso cromatográfico inicial, seguido de AEX con fines de purificación.


• Tras las etapas cromatográficas, se realiza una concentración y diafiltración finales para maximizar la pureza del producto y transferir el ARNm al tampón apropiado para su formulación o almacenamiento. En esta etapa, el ARNm puede purificarse, concentrarse y diafiltrarse aún más en la misma operación. Puede realizarse un paso de esterilización por filtración después de este paso de TFF; sin embargo, la filtración de grado esterilizante de ARNm con un peso molecular de 5 000 kDa o superior puede resultar difícil.

FORMULACIÓN DEL ARNm

Después de la etapa final de purificación del ARNm, la siguiente consideración es el mecanismo de liberación (Figura 4). Las herramientas de administración son cruciales para garantizar la eficacia de las vacunas y tratamientos de ARNm. Uno de los métodos de liberación más avanzados se basa en combinaciones de lípidos y polímeros, como los complejos de oligonucleótidos unidos a lípidos que forman un lipoplejo o polímeros con carga positiva, como la polietilenimina (PEI), que forman poliplejos. Las nanopartículas lipídicas (LNP) son la plataforma de liberación de ARNm más utilizada.

Figura 4. Se dispone de varios sistemas de liberación de ARNm.

Consideraciones para la selección de lípidos

A la hora de elegir los lípidos, es esencial tener en cuenta la vía de administración para garantizar la máxima eficacia y una biodistribución óptima. Junto con la selección de lípidos, la proporción entre cada lípido es crucial para el ajuste fino, lo que influye directamente en la fluidez de la bicapa y en la fusogenicidad de las LNP. A la hora de elegir un lípido entran en juego múltiples factores críticos, como el tipo, la fuente y la calidad, que influyen directamente en el perfil de impurezas y en propiedades como las características de las partículas, la estabilidad y el perfil de liberación en la formulación final. Para obtener resultados reproducibles es necesario que la calidad de los lípidos sea uniforme, lo que depende en gran medida de la calidad de las materias primas utilizadas para la síntesis de lípidos y de las características del material lipídico. Los lípidos sintéticos con una calidad de producto grande y constante, junto con unos servicios y una asistencia técnica personalizados proporcionados por un socio de confianza, son ideales para satisfacer las necesidades individuales y garantizar un rendimiento óptimo del producto final.

Cada nanopartícula lipídica (LNP) consta de cuatro lípidos diferentes que permiten el transporte del ARNm a su interior, así como su protección de la degradación.

• Se requieren lípidos catiónicos/ionizables para encapsular el ARN mediante interacciones electrostáticas. La liberación en los hepatocitos (para estimular o silenciar la expresión de las proteínas) requiere lípidos ionizables (focalización pasiva, liberación endosómica), mientras que la captación por las células inmunitarias es mucho más fácil. Los lípidos catiónicos fuertes también cumplen esta función y son responsables de la liberación eficaz del ARN en el citoplasma. La estructura de los lípidos catiónicos afecta significativamente a la actividad, toxicidad y biodistribución de las PNL.


• Los lípidos de polietilenglicol (PEG) proporcionan estabilidad coloidal e impiden la unión de proteínas a la partícula, protegiéndola así del sistema inmunitario y logrando una circulación más prolongada. La longitud de la cadena de PEG y de las cadenas de ácidos grasos determina la vida útil en circulación y la fusogenicidad, o en qué medida la partícula puede fusionarse con la membrana endosómica de la LNP. Para una circulación prolongada, pueden utilizarse cadenas de ácidos grasos más largas, como el polietilenglicol distearoil glicerol (DSG PEG 2000). La concentración de PEG afecta también al tamaño de las partículas. Sin embargo, el uso de PEG puede inducir la formación de anticuerpos, comprometiendo potencialmente la eficacia de la inmunización.


• Los lípidos neutros/aniónicos proporcionan estabilidad estructural y desempeñan un papel en la definición de la fusogenicidad y la biodistribución. 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. Por ejemplo, se demostró que las LNP que contenían 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), que desempeña un papel importante en la liberación endosómica, inducían una mayor liberación de ARNm al hígado en comparación con la 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC).⁵ Los resultados del estudio sugieren que estos lípidos auxiliares contribuyen también a la encapsulación estable del ARN.⁶


• El colesterol se utiliza para modular la densidad, la fluidez y la captación (formación de balsa) de la LNP en la bicapa. Si bien, en el mercado existen las versiones sintética y de origen animal del colesterol, el colesterol sintético ofrece varias ventajas, entre ellas una mayor pureza, la ausencia de moléculas de origen animal como los priones, la escalabilidad y una calidad muy constante.

El ARNm purificado puede formularse en la partícula de liberación mediante diferentes técnicas. En la técnica de inyección de disolvente utilizada habitualmente, los lípidos se disuelven en un disolvente como el etanol y se mezclan rápidamente en un tampón acuoso de pH bajo que contiene el ARNm utilizando una mezcla de flujo cruzado o una mezcla microfluídica para crear las LNP. A continuación, el tampón de pH bajo se diafiltra en un tampón neutro y se utiliza ultrafiltración para concentrar las partículas. El paso de TFF debe ser rápido, ya que los lípidos pueden hidrolizarse a un pH bajo, induciendo la formación de impurezas como los hidrolípidos que pueden afectar a la estructura de la bicapa lipídica, la estabilidad de la formulación y las características de liberación del fármaco. La degradación de los lípidos también puede aumentar el tamaño de la partícula y provocar agregación.

Las LNP tienen una estabilidad y plasticidad estructural muy buena, así como una mejor liberación génica, en comparación con otros sistemas de administración. Aumentan la velocidad de transfección en comparación con el ARNm desnudo, permiten la inyección intravenosa sin riesgo de degradación por las ARNasas presentes en el torrente sanguíneo y permiten la focalización activa si se incorporan ligandos específicos. Entre las desventajas de las LNP se encuentra el hecho de que pueden requerir logística de cadena de frío. Además, no siempre es posible la filtración esterilizante con las LNP; en tales casos deben considerarse alternativas, como la irradiación gamma, la esterilización por calor, la esterilización a alta presión o el procesamiento cerrado.

Si desea más información sobre la formulación de ARNm, lea nuestro libro blanco "Considerations for Advancing a Lipid Nanoparticle Formulation to Clinical and Commercial Manufacturing".

Consideraciones sobre el escalado

Hay varias consideraciones que deben tenerse en cuenta al escalar el proceso de fabricación de ARNm, y éstas deben ser fundamentales durante el desarrollo del proceso cuando se trabaja a pequeña escala.

• Los métodos en los que se utilizan etapas de extracción y precipitación de disolventes para la purificación de ARNm son difíciles de escalar; además, el uso de disolventes peligrosos no es adecuado para entornos GMP y pueden sustituirse por TFF o cromatografía.


• Dado que el ARNm puede ser degradado por las ARNasas en cuestión de segundos, toda la materia prima, las disoluciones y el equipo que entre en contacto con el producto debe estar libre de estas enzimas.


• El sistema de administración adecuado contribuye a la eficacia de la vacuna o el tratamiento y debe seleccionarse con sumo cuidado.


• Si el producto final es un complejo de ARNm grande, deben evaluarse las alternativas para la esterilización por filtración del producto.


• Los requisitos extraordinarios de la cadena de suministro (por ejemplo, la cadena de frío) son un impulsor del coste significativo. Por consiguiente, la estabilidad del fármaco debe evaluarse cuidadosamente.

ARNm: UN FUTURO BRILLANTE

La tecnología de ARNm ha permitido el desarrollo de candidatos a vacuna contra la COVID-19 con una velocidad sin precedentes y tasas de eficacia excepcionales. En el futuro, esta tecnología no sólo revolucionará el campo del desarrollo de vacunas, al permitir una respuesta rápida a los brotes de enfermedades, sino que también tiene el potencial de ser una plataforma rápida y flexible tanto para vacunas como para tratamientos que ayudarán a abordar necesidades médicas no cubiertas.

Sin embargo, para garantizar que este enfoque terapéutico alcance todo su potencial, deberán juntarse soluciones innovadoras, experiencia e ingenio para establecer una plataforma sencilla y robusta a escala de producción. Con nuestros productos, servicios y asistencia técnica de expertos, nos dedicamos a agilizar su proceso de toma de decisiones, ayudándole a recorrer el camino hacia el éxito de su medicamento de ARNm y a avanzar juntos en la fabricación de vacunas y tratamientos de ARNm.

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Referencias bibliográficas

1. Bancel S, Issa J, Aunins J. Ribonucleic acid purification (Patent No. WO2014152031A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152031A1/en

2. Kiesewetter A, Gupta A, Heinen‐Kreuzig A, Greenhalgh T, Stein A. 2023. Improved endotoxin removal using ecofriendly detergents for intensified plasmid capture. Biotechnology Progress. 39(6): https://doi.org/10.1002/btpr.3375

3. Bancel S, Issa J, Aunins J, Chakraborty T. 2014. Manufacturing methods for production of rna transcripts (Patent No. WO2014152027A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152027A1/en

4. Issa J, Barberio J, Aunins J, Aefyan N. Ion exchange purification of mRNA (Patent No. WO2014144767A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014144767A1/en

5. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, Shi Y, Sadtler K, Gao W, Lin J, et al. 2019. Delivery of mRNA vaccines with heterocyclic lipids increases anti-tumor efficacy by STING-mediated immune cell activation. Nat Biotechnol. 37(10):1174-1185. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0247-3

6. Kulkarni JA, Witzigmann D, Leung J, Tam YYC, Cullis PR. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. 11(45):21733-21739. https://doi.org/10.1039/c9nr09347h