Protocolo TRI Reagent^®

¿Qué hace TRI Reagent^®?

La disolución TRI Reagent^® (también vendida como TRIzol) es una mezcla de una mezcla de tiocianato de guanidina y fenol en una disolución monofásica que se utiliza para el aislamiento de ADN, ARN y proteínas de muestras biológicas humanas, de animales, vegetales, de levaduras, bacterias y virus. Inhibe la actividad ARNasa. TRI Reagent^® se utiliza para homogeneizar la muestra biológica de la que se extraen el ARN, el ADN o las proteínas.

Procedimientos

Preparación de las muestras

1A. Tejido:
Homogeneice las muestras de tejido en reactivo TRI (1 ml por 50–100 mg de tejido) en un homogeneizador Polytron^® u otro apropiado.

Nota: si desea una fragmentación mínima del ADN, utilice un homogeneizador de ajuste holgado, no un Polytron (vea Aislamiento del ADN,  paso 3, nota b). El volumen del tejido no debe superar el 10 % del volumen del reactivo TRI.

1B. Monocapas celulares:
Lise las células directamente en la placa de cultivo. Utilice 1 ml del reactivo TRI por 10 cm² de superficie de la placa de cultivo de vidrio. Después de agregar el reactivo, debe pasarse el lisado celular varias veces a través de una pipeta para formar un lisado homogéneo.

Nota: el reactivo TRI no es compatible con las placas de cultivo de plástico.

1C. Células en suspensión:
Aísle las células por centrifugación y luego líselas en reactivo TRI mediante pipeteo repetido. Un ml del reactivo es suficiente para lisar 5–10 x 10⁶ células animales, vegetales o levaduras, o 10⁷ células bacterianas.

Nota:

• si las muestras tienen un elevado contenido de grasa, proteínas, polisacáridos o material extracelular como músculo, tejido graso y partes tuberosas de las plantas, puede ser necesario un paso más. Después de la homogeneización, centrifugue el homogeneizado a 12 000 x g durante 10 minutos a 2-8 °C para eliminar el material insoluble (membranas extracelulares, polisacáridos y ADN de elevada masa molecular). El sobrenadante contiene ARN y proteínas. Si la muestra tenía un elevado contenido de grasa, habrá una capa de material graso sobre la superficie de la fase acuosa que debe eliminarse. Transfiera el sobrenadante transparente a un tubo nuevo y continúe con el paso 2. Recupere el ADN de alta masa molecular del sedimento siguiendo el procedimiento de aislamiento del ADN, pasos 2 y 3.
• Algunas levaduras y células bacterianas pueden requerir un homogeneizador.
• Después de homogeneizar o lisar las células en el reactivo TRI, las muestras pueden conservarse a –70 °C durante un máximo de 1 mes.

Separación de fases: Para asegurar la disociación completa de los complejos nucleoproteicos, deje reposar las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente. Añada 0,1 ml de 1-bromo-3-cloropropano o 0,2 ml de cloroformo (ver Separación de fases, nota a y b) por ml de reactivo TRI utilizado. Cubra bien la muestra, agite vigorosamente durante 15 segundos y deje reposar durante 2-15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugue la mezcla resultante a 12 000 xg durante 15 minutos a 2-8 °C. La centrifugación separa la mezcla en 3 fases: una fase orgánica roja (que contiene las proteínas), una interfase (que contiene el ADN) y una fase acuosa superior incolora (que contiene el ARN).

Nota:

• El 1-bromo-3-cloropropano es menos tóxico que el cloroformo y su uso para la separación de fases disminuye la posibilidad de contaminar el ARN con ADN.
• El cloroformo utilizado para la separación de fases no debe contener alcohol isoamílico ni otros aditivos.
• Para el aislamiento de la fracción poli A⁺ de la fase acuosa vea el Anexo I.

Aislamiento o extracción del ARN

1. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo y agregue 0,5 ml de 2-propanol por ml del reactivo TRI utilizado en la Preparación de la muestra, paso 1, y mezcle. Deje reposar la muestra durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugue a 12 000 x g durante 10 minutos a 2-8 °C.. El ARN precipitado formará un sedimento en el lateral y el fondo del tubo.

Nota: conserve la interfase y la fase orgánica a 2-8 °C para el aislamiento posterior del ADN y las proteínas.

2. Retire el sobrenadante y lave el sedimento de ARN agregando un mínimo de 1 ml de etanol al 75 % por 1 ml del reactivo TRI utilizado en la Preparación de la muestra, paso 1. Agite la muestra en un Vórtex y luego centrifugue a 7 500 x g durante 5 minutos a 2-8 °C.

Nota:

• Si el sedimento de ARN flota, realice el lavado en etanol al 75 % a 12 000 x g.
• Las muestras pueden conservarse en etanol a 2-8 °C durante al menos 1 semana y hasta 1 año a -20 °C.

3. Seque brevemente el sedimento de ARN durante 5 a 10 minutos al aire o al vacío. No deje que el sedimento de ARN se seque por completo, ya que esto disminuirá en gran medida su solubilidad. No seque el sedimento de ARN mediante centrifugación al vacío (Speed-Vac®). Agregue un volumen apropiado de formamida, agua o una disolución de SDS al 0,5% al sedimento de ARN. Para facilitar la disolución, mezcle mediante pipeteo repetido con una micropipeta a 55–60 °C durante 10–15 minutos.

Nota:

• La preparación final del ARN carece de ADN y proteínas. Debe tener un cociente A260 a A280 de ≥1,7.
• Rendimientos típicos de los tejidos (mg de ARN/mg de tejido): hígado, bazo, 6-10 mg; riñón, 3-4 mg; músculo esquelético, cerebro, 1-1,5 mg; placenta, 1-4 mg.
• Rendimientos típicos de las células cultivadas (mg de ARN/10⁶ células):  células epiteliales, 8-15 mg; fibroblastos, 5-7 mg.
• La tinción con bromuro de etidio del ARN en geles de agarosa permite visualizar dos bandas predominantes de ARN ribosómico pequeño (2 kb) y grande (5 kb), ARN de baja masa molecular (0,1–0,3 kb) y bandas discretas de ARN de elevada masa molecular (7–15 kb).

Aislamiento o extracción del ADN

1. Retire con mucho cuidado la fase acuosa que quede sobre la interfase y deséchela. Para precipitar el ADN de la interfase y la fase orgánica, agregue 0,3 ml de etanol al 100 % por 1 ml de reactivo TRI utilizado en la  Preparación de la muestra, paso 1. Mezcle por inversión y deje reposar durante 2-3 minutos a temperatura ambiente. Centrifugue a 2 000 x g durante 5 minutos a 2-8 °C.

Nota: la eliminación de la fase acuosa restante antes de la precipitación del ADN es una etapa crucial para la calidad del ADN aislado.

2. Retire el sobrenadante y guárdelo a 2-8 °C para el aislamiento de proteínas. Lave el sedimento de ADN dos veces en disolución de citrato trisódico 0,1 M, etanol al 10 %. Utilice 1 ml de la disolución de lavado por cada 1 ml de reactivo TRI utilizado en la Preparación de la muestra, paso 1. Durante cada lavado, deje reposar el sedimento de ADN (con mezcla ocasional) durante al menos 30 minutos. Centrifugue a 2 000 x g durante 5 minutos a 2-8 °C. Resuspenda el sedimento de ADN en etanol al 75 % (1,5–2 ml por cada ml de reactivo TRI) y deje reposar durante 10–20 minutos a temperatura ambiente.

Nota:

• Importante: No reduzca el tiempo de permanencia de las muestras en la disolución de lavado. Treinta minutos es el tiempo mínimo absoluto para la eliminación eficiente del fenol del ADN.
• Si el sedimento contiene > 200 mg de ADN o grandes cantidades de material que no sea ADN, se requiere un lavado añadido en una disolución de citrato de trisodio 0,1 M, etanol al 10 %.
• Las muestras suspendidas en etanol al 75 % se pueden conservarse a 2-8 °C durante varios meses.

3. Seque el sedimento de ADN durante 5-10 minutos al vacío y disuélvalo en NaOH de 8 mM con pipeteo lento repetido con una micropipeta. Añada suficiente NaOH 8 mM para una concentración final de ADN de 0,2–0,3 mg/ml (normalmente 0,3–0,6 ml al ADN aislado de 50–70 mg de tejido o 10⁷ células). Esta disolución alcalina suave asegura la disolución completa del sedimento de ADN. Centrifugue a 12 000 x g durante 10 minutos para eliminar cualquier material insoluble y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo.

Nota:

• Un sobrenadante viscoso indica la presencia de ADN de elevada masa molecular.
• El tamaño del ADN dependerá de la fuerza ejercida durante la homogeneización. Evite usar un homogeneizador Polytron.
• Las muestras disueltas en NaOH 8 mM se pueden conservar a 2-8 °C durante la noche. Para el almacenamiento prolongado, ajuste el valor de pH entre 7 y 8, y complemente con EDTA (concentración final 1 mM).
• Para determinar la concentración de ADN, retire una alícuota, diluya con agua y mida a A260.  Para el ADN bicatenario, 1 unidad A260/ml = 50 µg/ml.
• Para calcular el número de células, suponga que la cantidad de ADN en 10⁶ células diploides de humanos, rata y ratón es igual a 7,1 µg, 6,5 µg y 5,8 µg, respectivamente.
• Rendimientos típicos de los tejidos (µg ADN/mg tejido):  hígado, riñón, 3–4 µg; músculo esquelético, cerebro, y placenta, 2–3 µg.
• Rendimientos típicos de células humanas, de rata y ratón cultivadas: 5–7 µg de ADN/10⁶  células.

Para amplificar el ADN mediante PCR

Después de disolver en NaOH 8 mM, ajuste a pH 8,4 usando HEPES (añada 86 µl de una disolución de HEPES 0,1 M, sin ácido/ml de disolución de ADN). Agregue la muestra (generalmente 0,1–1 µg) a la mezcla de PCR y siga elprotocolo de PCR.

Para digerir el ADN con las enzimas de restricción

Ajuste el pH de la disolución de ADN al necesario para la digestión con enzimas de restricción usando HEPES o dialice las muestras contra EDTA 1 mM, pH 7–8. Deje que la digestión con la enzima de restricción continúe durante 3-24 horas en condiciones óptimas. Se recomienda utilizar 3-5 unidades de enzima por 1 µg de ADN. Por lo general, se digiere el 80-90 % del ADN.

Aislamiento de proteínas

1. Precipite las proteínas (véase la nota) del sobrenadante fenol-etanol (aislamiento del ADN, paso 2) con 1,5 ml de 2-propanol por 1 ml del reactivo TRI utilizado en la Preparación de la muestra, paso 1. Deje reposar las muestras durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugue a 12 000 x g durante 10 minutos a 2-8 °C.

Nota: para algunas muestras, el sedimento proteico puede ser difícil de disolver en SDS al 1 % (paso 3). Utilice este procedimiento alternativo para corregir el problema:

• Dialice el sobrenadante fenol-etanol contra 3 cambios de SDS al 0,1 % a 2-8 °C.
• Centrifugue el dializado a 10 000 x g durante 10 minutos a 2-8 °C.
• El sobrenadante transparente contiene proteínas que son adecuadas para utilizar en los procedimientos de inmunoelectrotransferencia.

2. Deseche el sobrenadante y lave el sedimento 3 veces en una disolución de clorhidrato de guanidina 0,3 M a etanol 95 % , utilizando 2 ml por 1 ml del reactivo TRI utilizado en la Preparación de la muestra, paso 1. Durante cada lavado, conserve las muestras en una disolución de lavado durante 20 minutos a temperatura ambiente. Centrifugue a 7 500 x g durante 5 minutos a 2-8 °C. Después de los 3 lavados, añada 2 ml de etanol al 100 % y agite en Vórtex el sedimento proteico. Deje reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Centrifugue a 7 500 x g durante 5 minutos a 2-8 °C.

Nota: las muestras proteicas suspendidas en una disolución de clorhidrato de guanidina 0,3 M a etanol 95 % o etanol al 100 % pueden conservarse durante 1 mes a 2-8 °C o 1 año a -20 °C.

3. Seque el sedimento proteico al vacío durante 5-10 minutos. Disuelva el sedimento en el SDS al 1 % añadido accionando el émbolo de la micropipeta con la punta en la disolución. Retire cualquier material insoluble mediante centrifugación a 10 000  x g durante 10 minutos a 2-8 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. La disolución proteica debe utilizarse de inmediato para Western blotting o conservarse a –20 °C.

Guía de resolución de problemas

1. Aislamiento del ARN:

A. El bajo rendimiento puede deberse a:

• homogeneización o lisis incompletas de las muestras.
• puede que el sedimento de ARN final no se haya disuelto por completo.

B. Si el cociente A260 a A280 es <1,65:

• puede que la cantidad de muestra utilizada para la homogeneización haya sido demasiado pequeña.
• puede que no se hayan dejado reposar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos después de la homogeneización.
• puede que la fase acuosa se haya contaminado con la fase fenólica.
• puede que el sedimento de ARN final no se haya disuelto por completo.

C. Si hay degradación del ARN:

• puede que los tejidos no se hayan procesado o congelado inmediatamente después de retirarlos del animal.
• quizá las muestras utilizadas para el aislamiento o los preparados de ARN aislados se hayan conservado a –20 °C en vez de a –70 °C, como se especifica en el procedimiento.
• las células pueden haber sido dispersadas por la digestión de tripsina.
• puede que las disoluciones acuosas o los tubos utilizados para el procedimiento no carecieran de ARNasas.
• el formaldehído utilizado para la electroforesis en gel de agarosa puede que tuviera un valor de pH < 3,5.

D. Si hay contaminación por ADN:

• puede que el volumen de reactivo utilizado para la homogeneización de la muestra haya sido demasiado pequeño.
• las muestras utilizadas para el aislamiento puede que contuvieran disolventes orgánicos (etanol, DMSO), tampones fuertes o disolución alcalina.

2. Aislamiento del ADN:

A. El bajo rendimiento puede deberse a:

• homogeneización o lisis incompletas de las muestras.
• puede que el sedimento de ADN final no se haya disuelto por completo.

B. Si el cociente A260 a A280 es <1,70:

• puede que no se haya eliminado lo suficiente el fenol de la preparación del ADN. Pruebe un lavado más del sedimento de ADN con la disolución de citrato de trisodio 0,1 M, etanol al 10 %.

C. Si hay degradación del ADN:

• puede que los tejidos no se hayan procesado o congelado inmediatamente después de retirarlos del animal.
• puede que las muestras utilizadas para el aislamiento se hayan conservado a –20 °C en vez de a –70 °C, como se especifica en el procedimiento.
• puede que las muestras se hayan homogeneizado con un Polytron u otro homogeneizador de alta velocidad.

D.  Si hay contaminación por ARN:

• puede que haya quedado demasiada fase acuosa con la fase orgánica y la interfase.
• es posible que el sedimento de ADN no se haya lavado lo suficiente con la disolución de citrato de trisodio 0,1 M, etanol al 10%.

3. Aislamiento de las proteínas

A. El bajo rendimiento puede deberse a:

• homogeneización o lisis incompletas de las muestras.
• puede que el sedimento final de proteínas no se haya disuelto por completo.

B. Si hay degradación de las proteínas:

• puede que los tejidos no se hayan procesado o congelado inmediatamente después de retirarlos del animal.

C. Si el PAGE muestra deformación de la banda:

• es posible que el sedimento proteico no se haya lavado lo suficiente.

Anexo

I. Aislamiento del poli A + ARN
Después de haber precipitado el ARN con 2-propanol (aislamiento del ARN, paso 1), disuelva el sedimento en un tampón de unión a poli A+ y hágalo atravesar una columna de celulosa oligo-dT para eliminar selectivamente el ARNm según el procedimiento de Aviv y Leder.³

II. El ARN aislado se utilizará en RT-PCR

1. La modificación del procedimiento realizando el paso de centrifugación añadida en la Preparación de la muestra, paso 1B, nota c, reduce aún más la posibilidad de contaminación por ADN en el ARN extraído con el reactivo TRI LS.

2. Se requiere una evaporación más completa del etanol cuando las muestras de ARN se van a utilizar en RT-PCR. Esto es especialmente crucial para muestras de pequeño volumen (5-20 μl), que pueden contener una cantidad relativamente elevada de etanol si no se secan bien.

Referencias bibliográficas

1. Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15(3):536-7.

2. Chomczynski P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162(1):156-159. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90021-2

3. Aviv H, Leder P. 1972. Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic acid-Cellulose. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69(6):1408-1412. https://doi.org/10.1073/pnas.69.6.1408

4. Chomczynski P, Mackey K. 1995. Substitution of Chloroform by Bromochloropropane in the Single-Step Method of RNA Isolation. Analytical Biochemistry. 225(1):163-164. https://doi.org/10.1006/abio.1995.1126