Limpieza de reacciones de marcaje de anticuerpos utilizando filtros Amicon^® Ultra

Cuando se utiliza un filtro para centrífuga Amicon^® Ultra ordinario, unas pocas rondas de diafiltración bastan para eliminar con eficacia el marcaje no incorporado en una una reacción de marcaje de anticuerpos sin diluir la muestra. Utilice el siguiente protocolo para eliminar el marcaje fluorescente que no haya reaccionado utilizando unidades de ultrafiltración para centrífuga.

Eliminación del marcaje fluorescente que no haya reaccionado en la reacción de conjugación de anticuerpos

1. Cargar 1 mg de disolución de anticuerpos marcados con fluorescencia en 2 ml en dos unidades Amicon^® Ultra-4 ml 10 kDa MWCO y centrifugar a 4 000 x g durante 10 minutos.
2. Volver a diluir los retenidos (aproximadamente 50 μl cada uno) hasta 2 ml con agua y volver a centrifugar. Repetir este paso dos veces.
3. Después de cada centrifugación, guardar las muestras del retenido y el filtrado para el análisis con SDS-PAGE y la cuantificación mediante espectroscopía UV-Vis.

Resultados

Figura 1. Se muestra el gel de SDS-PAGE de BSA marcado con FITC antes y después de cada uno de los cuatro ciclos de diafiltración. El FITC no incorporado es visible en el material de partida y en el primer filtrado. La mayor parte del marcaje libre se elimina después de un ciclo de ultrafiltración; prácticamente es indetectable FITC libre después de los siguientes ciclos de filtración. Los datos de medición de la fluorescencia de la Figura 2 confirman este resultado.

Figura 2. Después de la primera ultrafiltración la señal FITC libre se reduce en ~ 80 % , que disminuye aún más hasta el 98 % después de los ciclos de filtración subsiguientes. Esto demuestra la viabilidad de la ultrafiltración como alternativa a la filtración en gel para la limpieza de las reacciones de marcaje de proteínas.