Protocolos ELISA

• Procedimiento de análisis en sándwich
• Procedimiento de análisis de fosforilación
• Procedimiento de análisis EIA
• Procedimiento de análisis en células aisladas

Procedimiento de análisis en sándwich

1. Lleve todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente (18 - 25 °C) antes de utilizarlos. Se recomienda que todos los patrones y muestras se ejecuten al menos por duplicado.
2. Agregue 100 µl de cada patrón y muestra en los pocillos apropiados. Cubra los pocillos e incube durante 2,5 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C con agitación suave.
3. Deseche la disolución y lave 4 veces con disolución de lavado 1X. Lave llenando cada pozo con tampón de lavado (Wash Buffer) (300 µl) utilizando una pipeta multicanal o una lavadora automática. La eliminación completa del líquido en cada paso es esencial para un buen rendimiento. Después del último lavado, retire todo lo que quede del tampón de lavado aspirando o decantando. Invierta la placa y séquela contra toallas de papel limpias.
4. Agregue 100 µl de anticuerpo para detección preparado 1x a cada pocillo. Cubra los pocillos e incube durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave.
5. Deseche la disolución. Repita el procedimiento de lavado como en el paso 3.
6. Agregue 100 µl de disolución de estreptavidina preparada a cada pocillo. Cubra los pocillos e incube durante 45 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.
7. Deseche la disolución. Repita el lavado como en el paso 3.
8. Agregue 100 µl de reactivo sustrato de un paso TMB (producto H) a cada pocillo. Cubra los pocillos e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación suave.
9. Agregue 50 µl de disolución de parada (producto I) a cada pocillo. Lea inmediatamente la absorbancia a 450 nm.

Procedimiento de análisis de fosforilación

1. Lleve todos los reactivos a temperatura ambiente (18 - 25 °C) antes de utilizarlos. Se recomienda que todas las muestras o el control positivo se ejecuten al menos por duplicado.
2. Añada 100 µl de cada muestra o control positivo en los pocillos apropiados. Cubra los pocillos con un portaplacas e incube durante 2,5 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C con agitación.
3. Deseche la disolución y lave 4 veces con disolución de lavado 1x. Lave llenando cada pocillo con tampón de lavado (300 µl) utilizando una pipeta multicanal o una lavadora automática. La eliminación completa del líquido en cada paso es esencial para un buen rendimiento. Después del último lavado, retire todo lo que quede del tampón de lavado mediante aspiración. Invierta la placa y séquela contra toallas de papel limpias.
4. Agregue 100 µl de anticuerpo antifosfotirosina biotinilado 1X preparado a cada pocillo. Incube durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación.
5. Deseche la disolución. Repita el lavado como en el paso 3.
6. Agregue 100 µl de disolución HRP-estreptavidina preparada 1X (vea el paso 6 de Preparación de reactivos) a cada pocillo. Incube durante 45 minutos a temperatura ambiente con agitación.
7. Deseche la disolución. Repita el lavado como en el paso 3.
8. Agregue 100 µl de reactivo sustrato de un paso TMB (producto H) a cada pocillo. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con agitación.
9. Agregue 50 µl de disolución de parada (producto I) a cada pocillo. Lea inmediatamente a 450 nm.

Procedimiento de análisis EIA

1. Mantenga los reactivos del kit en hielo durante los pasos de preparación del reactivo. Se recomienda que todos los patrones y muestras se ejecuten al menos por duplicado.
2. Agregue 100 μl de anticuerpo anti-“diana” a cada pocillo. Incube durante 1,5 horas a temperatura ambiente con agitación suave (1-2 ciclos/seg). También puede incubar durante la noche a 4 °C.
3. Deseche la disolución y lave los pocillos 4 veces con tampón de lavado 1x (200-300 μl cada uno). El lavado se puede hacer con una pipeta multicanal o una lavadora de placas automatizada. La eliminación completa del líquido en cada paso es esencial para un buen rendimiento del análisis. Después del último lavado, retire todo lo que quede del tampón de lavado mediante aspiración o decantación. Invierta la placa y séquela contra toallas de papel limpias.
4. Agregue 100 µl de cada patrón, control positivo y muestra en los pocillos apropiados. Asegúrese de incluir un pocillo de blanco (solo Diluyente del análisis). Cubra los pocillos e incube durante 2,5 horas a temperatura ambiente con agitación suave (1-2 ciclos/seg) o durante la noche a 4 °C.
5. Deseche la disolución y lave 4 veces como se indica en el paso 3.
6. Añada 100 μl de la disolución preparada de HRP-estreptavidina a cada pocillo. Incube durante 45 minutos con un agitación suave a temperatura ambiente. Se recomienda que el tiempo de incubación no sea ni inferior ni superior a 45 minutos.
7. Deseche la disolución y lave 4 veces como se indica en el paso 3.
8. Agregue 100 µl de reactivo sustrato de un paso TMB (producto H) a cada pocillo. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con agitación suave (1-2 ciclos/seg).
9. Agregue 50 µl de disolución de parada (producto I) a cada pocillo. Lea inmediatamente la absorbancia a 450 nm.

Procedimiento de análisis en células aisladas

NOTA: TODAS las incubaciones y pasos de lavado deben realizarse con un balanceo o rotación suaves (~1-2 ciclos/segundo).

1. Diseñe su experimento.
   OPCIONAL: si siembra células HUVEC, HMEC‐1 u otras células ligeramente adheridas, cubra la microplaca de 96 pocillos no recubierta (PRODUCTO A) añadiendo 100 μl de poli-L-lisina (Producto recomendado Sigma-Aldrich n.º de referenciaP4832) en cada pocillo y siga las instrucciones del fabricante. Puede utilizarse una microplaca CellBIND^® prerrecubierta u otra placa de cultivo de tejido tratada con poli-lisina en lugar del PRODUCTO A.
2. Siembre 100 μl de 10 000 a 30 000 células en cada pocillo de la microplaca de 96 pocillos no recubierta (PRODUCTO A) suministrada e incube durante la noche a 37 °C con 5 % de CO₂.
   NOTA: el número óptimo de células utilizado variará en función de la línea celular y la cantidad relativa de fosforilación de proteínas. Se pueden usar más o menos células, pero esto debe determinarse empíricamente. NOTA: las células pueden dejarse sin alimentación ~4-24 horas (dependiendo de la línea celular) antes del tratamiento con inhibidores o activadores.         
3. Aplique varios tratamientos, inhibidores (como siRNA o productos químicos) o activadores de acuerdo con las instrucciones del fabricante e incube los tiempos deseados. 
   NOTA: se recomienda disolver los inhibidores o activadores en un medio de cultivo celular sin suero antes de tratar las células (a menos que se indique lo contrario en las instrucciones del fabricante).       
4. Deseche el medio de cultivo celular poniendo la microplaca boca abajo y dando golpes suaves en el fondo de la microplaca sobre el fregadero.
5. Lave pipeteando 200 μl del tampón preparado de lavado A 1X (PRODUCTO B) en cada pocillo. Deseche el tampón de lavado (como en el paso 4) y lave 2 veces más durante un total de 3 lavados usando tampón de lavado reciente cada vez. Después del lavado final, seque suavemente la microplaca en una toalla de papel para eliminar cualquier exceso/resto de tampón.
   NOTA: para evitar la pérdida de células, no pipetee directamente sobre las células. En su lugar, deje bajar suavemente el líquido por la pared de los pocillos de cultivo celular. Evite también utilizar aspiración al vacío o golpear con demasiada fuerza la microplaca cuando descarte cualquier disolución.       
6. Agregue 100 μl de disolución fijadora (PRODUCTO D) en cada pocillo e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: la disolución de fijación se utiliza para permeabilizar las células.  
7. Repita el paso de lavado 5.
8. Agregue 200 μl de tampón de extinción (quenching) 1X preparado (PRODUCTO E) en cada pocillo e incube 20 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: el tampón de extinción se utiliza para minimizar la respuesta de fondo.  
9. Lave 4 veces con tampón de lavado A 1X.
10. Agregue 200 μl del tampón de bloqueo 1X preparado (PRODUCTO F) en cada pocillo e incube durante 1 hora a 37 °C.. 
    
11. Lave 3 veces con tampón de lavado B 1X preparado (PRODUCTOO C).
    NOTA: si es preciso, la microplaca puede conservarse a –80 °C durante varios días después de este lavado.
12. Añada 50 μl del anticuerpo primario preparado 1X (PRODUCTO G-1, G-2, G-3, H-1, H-2 o H-3) en cada pocillo correspondiente e incube durante 2 horas a temperatura ambiente.
13. Lave 4 veces con tampón de lavado B 1X.
14. Agregue 50 μl del anticuerpo secundario conjugado con HRP preparado 1X (PRODUCTO I-2) en cada pocillo e incube durante 1 hora a temperatura ambiente.
15. Repita el paso 13.
16. Añada 100 μl del sustrato de TMB (PRODUCTO J) en cada pocillo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
17. Añada 50 μl de la disolución de parada (PRODUCTO K) en a cada pocillo. Lea inmediatamente a 450 nm.

Estos protocolos están previstos para ser utilizados únicamente como guía. Consulte al boletín técnico detallado de cada kit para instrucciones específicas.